GA3和ABA对2个黑穗醋栗品种二次萌发超微结构的影响

张椿浩， 刘庆帅， 薛晓晓， 秦 栋， 霍俊伟

(东北农业大学园艺园林学院/农业部东北地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

黑穗醋栗(RibesmigrumL.)别称黑加仑，俗称黑豆，属虎耳草科(Saxifragaceae)茶藨子属[1]，非常适宜寒地栽培，在我国已有百年的栽培史，迄今是黑龙江省的特色浆果树种之一[2]。黑穗醋栗果实中含有多种类黄酮、氨基酸、矿物质(其中Ca含量为水果之最)、醇类、酯类以及维生素(富含大量维生素A、B、C和B3)[3]。其中所含维C含量居我国现有野生浆果资源之首，有“维C王果”的美誉[4]。果汁中含有能够阻断强致癌物质亚硝基吗啉合成的物质，具有一定抑制癌细胞的作用。黑穗醋栗籽中的γ-亚麻酸是人体必需脂肪酸之一，具有降血脂作用，并且它可通过减少前列腺素E2的产生可减轻炎症反应[5]。黑穗醋栗色素属于花色苷类，在食品、医药、日用化学工业上有着广阔的应用前景[6]。

黑穗醋栗作为寒地小浆果的代表树种，黑龙江种植面积较大，产量可以占到全国的75%左右[7]。但是在实际生产中，黑龙江地区黑穗醋栗种植常伴有“二次萌发”现象，严重威胁产业发展。二次萌发现象发生在8月，黑龙江地区有短暂的温度骤升阶段，有研究表明短暂的高温处理会解除果树休眠[8-10]，而此时的芽再次萌发使树势遭到破坏，树体营养严重流失，影响翌年产量。前人在研究过程发现杨树的芽季节性休眠中会发生细胞壁加厚、阻断胞间连丝影响细胞间联系的现象，从而起到促进休眠发生的作用[11]。冬小麦在春化解除休眠过程中，茎尖细胞发生了核膜孔开放，线粒体数量增加等现象[12]。这都说明了植物解除休眠进程与细胞超微结构有着相应的关系，但研究大多集中在细胞超微结构与春季萌发方面，二次萌发相关研究却甚少。有关黑穗醋栗二次萌发的调控，笔者所在课题组已进行初步研究，发现25 mg/L GA3可明显促进二次萌发，而50 mg/L ABA则会抑制二次萌发的发生[13]。本试验以黑穗醋栗不易二次萌发品种黑丰和易二次萌发品种亚德为试验材料，从细胞超微结构入手，通过不同激素处理比较芽细胞的特征变化，以期从细胞学角度揭示二次萌发现象的机理，为全面揭示黑穗醋栗二次萌发的机理提供科学依据，为人工调控黑穗醋栗二次萌发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年8月在东北农业大学黑穗醋栗种质资源圃进行，选择8年生生长势相对一致的黑丰和亚德各15株，试材常规管理，长势中庸。黑丰属于我国自己选育品种，自然条件下不易二次萌发，亚德是从俄罗斯引进品种，具有易二次萌发的特性。

1.2 试验方法

1.2.1 试验处理 配制30 mg/L GA3、50 mg/L ABA，以清水处理为对照，在果实采收后开始处理，于2015年8月12日进行第1次采样，作为取样空白对照。从8月13日开始，连续 3 d 对黑丰植株进行处理，喷施GA3、ABA和清水各5株，叶片滴水为止，然后剪取1年生枝条带回试验室，将芽剥离并进行超微结构试验观察固定。从8月16日开始观察芽的形态学，在芽萌发的各个时期取1年生枝条的芽进行固定，用于超微结构观察。

1.2.2 透射电镜观察 将取回的芽修成1 mm×3 mm大小，用2.5%戊二醛固定2 h，然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值 6.8)漂洗3次，再用1%锇酸固定液固定2～3 h，用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液再漂洗3次。在4 ℃冰箱中按浓度梯度为50%、70%、90%、100%的乙醇分别进行15～20 min的脱水处理，后在室温下用100%丙酮进行5～10 min的脱水处理。用纯丙酮和包埋液在室温下进行浸透，次日包埋。待包埋液聚合后修块，用ULTRACUT-E超薄切片机切成50～60 nm 的薄片，再用醋酸铀-枸橼酸铅双染色，在东北农业大学生命科技中心电镜室内通过H-7650X型透射电镜观察并拍片。

2 结果与分析

2.1 黑丰芽内超微结构特征及变化

2.1.1 清水处理下黑丰芽内超微结构特征及变化 不易二次萌发品种黑丰在清水处理下芽内超微结构并没有发生显著变化。选择处理前(8月12日)、处理后3 d(8月17日)和处理后9 d(8月21日)进行对比分析，8月12日采集的芽处于质壁分离状态，细胞中游离淀粉粒，液泡中有电子致密物质，未观察到有线粒体、内质网和胞间连丝出现(图1-1)。8月17日采集的芽仍处于质壁分离状态，可清晰观察到内质网和线粒体，并且结构分化很完整；未观察到有胞间连丝出现(图1-2)。8月21日采集的芽细胞中质壁分离现象已经消失，大部分细胞已经形成中心大液泡，部分细胞液泡中仍有电子致密物质未分解；细胞中游离着淀粉粒未分解，可以清晰观察到线粒体存在，并且结构分化很完整；未观察到胞间连丝(图1-3)。

2.1.2 GA3处理下黑丰芽内超微结构特征及变化 不易二次萌发品种黑丰在GA3处理下芽内超微结构发生显著的变化。选择处理前(8月12日)、处理后3 d(8月17日)和处理后7 d(8月21日)进行对比分析，8月12日采集的芽处于质壁分离状态。8月17日采集的芽细胞质壁分离现象已经消失，中心大液泡基本形成，液泡中的电子致密物质已经分解；可以观察到细胞中存在较大体积的淀粉粒，线粒体结构明显，体积较大；观察细胞壁可发现胞间连丝分化，细胞壁周围有内质网存在(图1-4、图1-5)。8月21日采集的芽细胞中心大液泡已经形成，细胞质中游离少量淀粉粒，淀粉粒与17日相比体积明显变小；线粒体体积减小，但数量增加；可以观察到胞间连丝(图1-6)。

2.1.3 ABA处理下黑丰芽内超微结构特征及变化 不易二次萌发品种黑丰在ABA处理下芽内超微结构发生较大的变化。选择处理前(8月12日)和处理后7 d(8月21日)进行对比分析，8月21日采集的芽细胞处于质壁分离状态；液泡中存在较多电子致密物质；淀粉粒数量较多，且体积较大；可以观察到内质网存在；线粒体和胞间连丝未发现(图1-7)。

2.2 亚德芽内超微结构特征及变化

2.2.1 清水处理下亚德芽内超微结构特征及变化 易于二次萌发品种亚德在清水处理下芽内超微结构变化明显。选择处理前(8月12日)、处理中(8月14日)和处理后14 d(8月26日)进行对比分析，结果表明，8月12日采集的芽细胞并没有发生质壁分离现象；液泡占据细胞大部分体积；细胞中游离许多体积较小的线粒体；此时并未发现内质网和胞间连丝结构(图2-1)。8月14日细胞中液泡体积进一步增加，线粒体结构更加完整，体积变大；此时仍未观察到内质网和胞间连丝出现(图2-2)。8月26日细胞形成中心大液泡；淀粉粒消失，线粒体数量减少，体积明显增大，可以观察到内质网和胞间连丝(图2-3)。

2.2.2 GA3处理下亚德芽内超微结构特征及变化 8月12日芽细胞内各类细胞器均存在，并未发生质壁分离现象(图2-1)。8月14日细胞液泡通过水合作用逐步扩大；线粒体结构清晰，体积增大；可清楚观察到胞间连丝(图2-4)。8月21日细胞分化出细胞核，可以观察到核仁的存在；细胞中形成了单独的大液泡；淀粉粒数量明显减少，线粒体数量进一步增加，体积变大；内质网出现在细胞壁附近(图2-5)。8月29日亚德已完全二次萌发，芽细胞已经形成中心大液泡，细胞核分解消失；细胞壁周围分布了丰富的线粒体和内质网，胞间连丝对胞间联系起到了积极作用(图2-6)。

2.2.3 ABA处理下亚德芽内超微结构特征及变化 ABA处理下亚德芽内超微结构并未发生明显变化。8月14日亚德芽细胞发生了部分质壁分离，并且淀粉粒体积较大；线粒体数量较多，但体积较小(图2-7)。8月26日亚德芽细胞处于质壁分离状态，淀粉粒已消失；细胞形成中心大液泡；线粒体和内质网数量与之前相比明显减少(图2-8)。

3 讨论

黑穗醋栗富含多种维生素、糖类和有机酸，是制作果酱、果酒、饮料等不可或缺的原料。我国目前的栽培面积已有 5 000 多hm2[14]，但黑龙江地区在实际生产过程中出现的二次萌发现象严重影响了产业的健康发展。笔者所在课题组前期通过试验已证明GA3和ABA可有效调控黑穗醋栗二次萌发现象[13]，但黑穗醋栗二次萌发的研究机理尚不清楚，尤其是细胞学方面。黑丰作为我国自主选育品种，具有不易二次萌发的优良特性，本试验通过激素处理，利用电镜观察芽的细胞超微结构，以期从细胞学角度解释二次萌发的发生机理。

黑丰作为不易二次萌发的黑穗醋栗品种，在黑龙江地区具有较强的种植优势。亚德作为从俄罗斯引进品种，具有早熟等优良性状，但在秋季易发生二次萌发。本试验通过GA3与清水处理的对比、ABA与清水的对比发现，GA3可有效促进质壁分离现象消失；而ABA则恰恰相反。丁小余等指出，细胞在休眠期普遍发生质壁分离现象，说明GA3可以促进黑穗醋栗打破休眠，从而促进二次萌发，ABA则是起抑制作用[15]。黄义江等对5个苹果属果树品种抗寒性的研究中指出，质壁分离现象与胞间连丝关系密切，当质壁分离时胞间连丝相应中断，二者成正比关系[16]。不易二次萌发的黑丰进行GA3处理，可以在芽细胞中观察到胞间连丝出现，而清水和ABA处理黑丰均未发现胞间连丝分化。对易于二次萌发的亚德进行ABA处理，发现细胞未分化胞间连丝。与黑穗醋栗二次萌发情况相对应，总结出只有细胞分化出胞间连丝黑穗醋栗芽才可萌发。研究指出，崇明水仙顶端生长点进行超微结构观察，在营养生长期胞间连丝处于“通路状态”；休眠期间胞间连丝会被电子致密物质堵塞；随休眠解除，电子致密物质会逐渐分解，胞间连丝回复畅通[17]。Jian等通过研究推测胞间连丝是否通畅可作为休眠或解除休眠一种响应机制[18]。本试验并未观察到胞间连丝的闭塞状态，但激素处理具有鲜明对比，诱导胞间连丝分化可加强细胞间联系，从而起到诱导黑穗醋栗二次萌发的效果。由此可看出，胞间连丝是黑穗醋栗能否二次萌发的关键所在。

每个植物细胞均有形成胞间连丝的潜在能力，通过胞间连丝的转运功能，因此完整植物可以看成一个共质体[19]。质膜和内质网桥构成了共质体通道，因此内质网与细胞间物质运输有密切关联，对植物的解除休眠有一定影响。简令成等对杨树芽进行短日照处理诱导其进入休眠期，发现内质网发生收缩，打破了膜系统之间的联系；长日照处理的内质网收缩消失[20]。本试验通过GA3和ABA处理黑穗醋栗，与长短日照起类似作用，GA3处理后芽细胞内质网出现更早，长度更长。由此推测内质网在黑穗醋栗二次萌发过程中起重要作用。

线粒体作为细胞发生氧化还原反应和能量转换的主要场所，线粒体敏感而容易发生变化[21]。高文远等在浙贝母休眠前后超微结构比较中提出，细胞间物质与信息交换增加是细胞活跃的指标之一，线粒体大量出现在细胞壁周围与胞间联系增加有关[22]。通过对GA3处理的黑丰与亚德进行超微结构观察发现，细胞中线粒体均出现在细胞壁胞间连丝周围，这说明二次萌发过程中线粒体非常活跃，为细胞间的联系提供能量保障。GA3处理后线粒体分化数量明显多于清水处理，并且结构更加完整，体积更大，可以为细胞代谢提供充足能量；ABA处理则可明显观察到线粒体体积与数量减小。清水处理条件下，亚德细胞中线粒体数量明显多于黑丰。本试验观察到在二次萌发后期黑丰细胞中线粒体成纺锤状，说明此时线粒体处于积极增殖时期[23]；而亚德细胞中线粒体此时已经结构非常完整，内部嵴状结构清晰，已经可以充分供能。

从超微结构观察发现，黑穗醋栗芽细胞主要以淀粉粒的方式储藏能量。随着二次萌发进程的加深，淀粉粒体积不断变小，数量减少，说明淀粉粒通过自身水解为细胞代谢提供能量。孙红梅等发现，兰州百合在解除休眠过程中淀粉含量逐渐减少，这与本试验观察淀粉粒体积和数量变化相吻合[24]。本试验发现，不同激素处理会对淀粉粒分解产生一定影响，GA3处理后细胞中淀粉粒完全分解，而ABA处理的细胞中仍可以观察到淀粉粒存在。清水处理下，易二次萌发的亚德细胞中淀粉粒完全分解，而不易二次萌发的黑丰细胞中仍有淀粉粒剩余。这说明淀粉粒水解产生的能量对黑穗醋栗二次萌发起着重要作用。

液泡作为一个水相体系，积极地参与细胞代谢活动，对外界环境具有缓冲作用，维持胞内环境稳定。本试验发现8月12日黑丰液泡中存在电子致密物质，侯燕平等通过观察冬季珍珠梅顶芽细胞结构得出结论，液泡中电子致密物质的积累是植物抗寒的一种预防机理[25]。清水处理下，黑丰与亚德细胞在二次萌发过程中液泡电子致密物质均发生降解，说明细胞处于解除休眠的过程中。ABA处理9 d后，黑丰液泡中仍可以观察到有电子致密物质存在，而亚德细胞液泡中电子致密物质完全降解。液泡中电子致密物质未分解，则液泡浓度提高。方强恩在苜蓿根颈芽中同样发现了液泡大量内吞的现象，认为提高液泡浓度、降低冰点，有利于提升抗寒性[26]。因此，不易二次萌发的黑丰对于不良环境的抗逆性要强于亚德。

4 结论

黑穗醋栗二次萌发实际上是解除休眠的过程，休眠进程与细胞超微结构有着密切联系。本试验通过对2种黑穗醋栗进行激素处理，通过电镜观察发现，GA3可加快细胞代谢，促进细胞加速休眠期解除进程。GA3与ABA、清水处理最大区别在于是否诱导了胞间连丝的分化。胞间连丝在胞间信息与物质传递过程中有着不可或缺的重要作用，这可能是决定黑穗醋栗是否可以二次萌发的关键原因。通过观察其他细胞器，GA3处理下线粒体、内质网、淀粉粒均较ABA和清水处理更加活跃，这为二次萌发提供了物质基础。质壁分离为检验细胞是否在休眠期中的一个指标，GA3处理大大加快了细胞打破休眠，而ABA则起抑制作用。液泡作为最敏感的细胞器，ABA处理使液泡中电子致密物质不分解，大大提高了植物预防不利环境因素的能力。

本试验初步推测了黑穗醋栗二次萌发各个细胞器的代谢规律，但未与黑穗醋栗春季萌发相对比。在下一阶段试验中会加强这部分的研究，以期从细胞学的角度解释黑穗醋栗二次萌发的发生机理。