竹荪间作对橡胶园土壤微生物区系与群落功能多样性的影响

刘 敏， 张广宇， 张永北， 李智全， 冀春花

(海南省农垦科学院，海南海口 570206)

林下经济是一种人工生态经济复合系统，其投入小、见效快。近年来，林下经济蓬勃发展，其中林菌循环经济模式是最具林业特色的林下经济发展模式[1]。林菌循环经济模式就是利用林木枝桠作为栽培料，在林下阴蔽环境中开展食用菌栽培，再将菌糠还田培土以促进林木生长的一种可持续发展的复合种植模式。目前，各地区因食用菌种类、林地资源差异等因素形成了多样的林菌循环经济模式。海南省作为天然橡胶主产区，光温资源丰富，林下空间广阔，十分适合中高温型食用菌生产。近年来，竹荪因市场前景广阔、喜偏酸性土壤等特点已在海南省橡胶园大面积推广。

食用菌菌糠含有丰富的植物养分、有机质和微生物，施入土壤后，会对土壤物理、化学、生物性质产生一系列影响，可提高土壤孔隙度，增强土壤通透性，提升土壤养分含量，增加土壤微生物种群及数量，促进作物生长[2-3]。陈兵等研究表明，竹荪间种后，将菌糠施入使胶园，土壤水分状态显著得到改善，有机质、速效氮、速效钾、有效磷等养分含量显著提高，使地力培肥，橡胶产量提高[4]。而施用竹荪菌糠对橡胶园土壤微生物影响的研究还未见报道。土壤微生物作为反映土壤肥力的重要指标，其种类、数量和活性可以更全面、真实地反映土壤的营养状态[5]。因此本研究采用传统培养和BIOLOG ECO微平板法测定相结合的方法，研究竹荪间种对橡胶园土壤微生物区系和群落功能多样性的影响，试图以此评价“橡胶-竹荪”胶菌循环经济模式的土壤改良效果，以期为推广该模式提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

土壤样品采集地点位于海南省万宁市北大镇某橡胶林地，土壤类型为赤红壤，橡胶定植时间为2002年，种植规格为 2.8 m×7 m，采用“一行三畦两沟”模式在橡胶园行间栽培长裙竹荪。土壤样品采集采用“S”形5点混合法，分别于竹荪种植前(2015年12月8日)、竹荪采收时(2016年4月19日)和竹荪采收后3个月(2016年7月12日)用木铲从地表向下取0～20 cm新鲜土样。除种植前，土壤样品采集时需先将上层栽培料剥离干净。样品采集后低温运输，立即送回实验室进行测定。

1.2 土壤微生物数量测定

根据《土壤微生物研究原理与方法》[6]，采用平板计数法测定土壤中细菌、真菌、放线菌、氨化细菌、自生固氮菌数量，采用最大或然数(most probable number，简称MPN)计数法测定土壤中纤维素分解菌、硝化细菌、反硝化细菌数量。细菌、真菌、放线菌、氨化细菌、自生固氮菌、纤维素分解菌、硝化细菌、反硝化细菌分别使用营养琼脂、玫瑰红钠、高氏1号、牛肉膏蛋白胨、阿须贝无氮、赫奇逊、铵氧化细菌、反硝化细菌培养基培养。

1.3 土壤微生物群落碳源代谢利用测定

采用BIOLOG ECO微平板法。具体方法如下：称取10 g新鲜土壤于90 mL灭菌去离子水中，置于摇床振荡10 min，按10倍稀释法制成10-2土壤稀释液，静置2 min，取上清液接种到BIOLOG ECO PlateTM板(BIOLOG Inc，USA)的微孔内，每孔150 μL。将微孔板置于28 ℃培养箱中培养9 d，并每隔 24 h 用BIOLOG微生物鉴定仪读取590、750 nm处的吸光度。取120 h平均吸光度(average well color development，简称AWCD)进行主成分分析。

微生物对各类碳源相对利用率的测定参考皱春娇等的方法[7]，以所有样品中6 类碳源的最大AWCD值记为100%，其余各样品中各类碳源AWCD值与最大值的比值即为相对利用率。

1.4 多样性指数

通过计算McIntosh、Shananon-Wiener和Simpson指数来反映土壤微生物碳源利用多样性。

1.5 数据处理

使用Excel 2010和SPSS 19.0进行相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 竹荪间作对橡胶园土壤主要微生物类群数量的影响

由表1可知，橡胶园间作竹荪后，土壤微生物总数明显增加，采收时和采后3个月分别增加了66.72%和124.25%。采收时和采后3个月细菌总数略有增加；真菌总数显著减少，分别减少了 71.84%和67.82%；放线菌总数明显增加，分别增加了 1 966.67% 和2 833.33%，差异达极显著水平。由此可见，间作竹荪可提高橡胶园土壤微生物总量，促进放线菌生长，抑制真菌生长。

表1 竹荪间作前后橡胶园土壤主要微生物类群数量

注：同列数据后标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标有不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。表3同。

2.2 间作竹荪对橡胶园土壤微生物特殊生理类群的影响

由表2可知，采收时，橡胶园土壤中氨化细菌、自生固氮菌、纤维素分解菌、硝化细菌、反硝化细菌数量较种前分别增加了292.77%、107.06%、1 166.67、900.00%、9 900.00%。采后3个月，除反硝化细菌，各微生物生理群数量较采收时分别增加了43.56%、18.18%、110.53%、66.67%。间作前，氨化细菌、自生固氮菌为橡胶园土壤中主要生理类群；采收时，反硝化细菌数量骤增，替代自生固氮菌成为主要生理类群；采后3个月，纤维素分解菌替代反硝化细菌成为主要生理类群。由此可见，竹荪间作对橡胶园土壤各类群微生物生长繁殖有促进作用，主要生理类群随采样时间变化而更替。

表2 竹荪间作前后胶园土壤微生物特殊生理类群数量

2.3 间作竹荪对橡胶园土壤微生物群落功能多样性的影响

2.3.1 土壤微生物利用碳源动力学特征 AWCD表征土壤微生物群落对碳源的利用情况及活性，是表征土壤微生物群落碳源代谢能力的一个重要指标[8]。间作前后橡胶园土壤微生物利用31种碳源的AWCD值变化曲线如图1所示，可见AWCD值随培养时间的增长而升高，碳源利用程度增大，168 h后趋于稳定状态。间作前后橡胶园土壤AWCD值变化速率(斜率)表现为采后>采收>种前，采后3个月橡胶园土壤AWCD值增长最快，微生物对碳源的总体代谢活性最高。对168 h(拐点)处AWCD值进行方差分析，结果表明，采收时、采后3个月与种前土壤AWCD值差异极显著(P<0.01)。

2.3.2 土壤微生物对各类碳源的利用特征 BIOLOG ECO微平板的碳源包括12种碳水化合物类、5种羧酸类、6种氨基酸类、4种多聚物类、2种酚酸类和2种胺类[9]。竹荪间作前后橡胶园土壤中微生物对6类碳源的相对利用率如图2所示，可见碳水化合物、氨基酸类碳源有较高的利用率，其次为羧酸类和多聚物类，胺类、酚酸类的利用率最低。采收时，土壤微生物对各类碳源利用率均有所提高，其中多聚物类与种植前差异显著，酚酸和碳水化合物类差异极显著；与采收时相比，采后3个月除碳水化合物类碳源利用率略微下降外，其他类碳源利用率均有所升高，但幅度较小，仅羧酸类与采收时差异显著。

2.3.3 土壤微生物功能多样性指数 选取168 h处AWCD值，计算McIntosh、Shananon-Wiener和Simpson指数来反映土壤微生物碳源利用多样性。如表3所示，采收时各土壤微生物碳源利用多样性指数均高于种植前，Shannon-Wiener指数差异显著，McIntosh和Simpson指数差异极显著。采后3个月各指数较采后略有增加，但差异不显著。由此可见，间种竹荪后，橡胶园土壤微生物的均匀度、丰富度和优势度均有所提高。

表3 供试土壤中微生物碳源利用多样性指数

2.3.4 土壤微生物群落功能多样性的主成分分析 对3组土壤样品31种碳源168 h处的AWCD值进行主成分分析，得到特征值大于1的主成分2个，其中第1主成分方差贡献率为71.41%，第2主成分方差贡献率为28.59%。由表4 各碳源在第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)上的载荷值可知，对PC1贡献大(载荷值>0.8)的碳源有21种，其中碳水化合物类9种，多聚物类4种，氨基酸和羧酸类各3种，酚酸类和胺类各1种。对PC2贡献大(载荷值>0.8)的碳源有5种，其中氨基酸类2种，碳水化合物类、羧酸类和胺类各1种。取主成分1和2得分载荷作图，来表征间作前后土壤中微生物群落碳源代谢特征。如图3所示，竹荪间作前后土壤中微生物对碳源的利用情况不同，具有明显差异。

3 讨论

土壤中细菌、放线菌和真菌数量及其比例是衡量土壤肥力及健康状况的重要指标。一般说来，土壤中细菌、放线菌密度越高，该土壤肥力水平也就越高。研究表明，双孢菇、香菇和茶树菇等菌糠还田均可提高土壤微生物数量，提升细菌、放线菌所占比例，促进养分活化与吸收[10-12]。本试验结果显示，橡胶园间作竹荪后，土壤细菌、放线菌数量增加，真菌数量减少，放线菌与真菌数量比值(A/F值)明显提高，橡胶园土壤肥力得到了提升，同时，真菌相对数量的降低可能会对减轻橡胶病害起到积极作用[12]。

土壤中存在自生固氮菌、氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、纤维分解细菌等微生物生理群，它们在土壤养分循环和污染降解转化中起着重要作用[6]。间作竹荪后，橡胶园土壤5种微生物量均有所增加。其中，自生固氮菌、氨化细菌、硝化细菌与纤维素分解菌都是参与土壤养分循环的有益微生物生理群。自生固氮菌数量增加，可增加土壤氮素营养；氨化细菌、硝化细菌数量增加，有利于含氮有机物富集、分解和氮素循环速率的提高；纤维素分解菌数量增加，可加快植物残体转化和碳素循环，为胶树生长提供更多碳素和能源[13-15]。然而，反硝化细菌数量增加会造成氮素损失，采收阶段出现这种现象的原因可能是菇畦覆盖形成了微氧条件，为其提供了良好的生存环境。但随着竹荪栽培料持续分解和氧气的进入，反硝化细菌数量在采后3个月明显下降，占比仅为13.42%。也有研究表明，反硝化细菌数量与土壤养分呈正相关，对提高土壤肥力有促进作用[16]。总的来说，竹荪栽培料或菌糠的施入促进了微生物类群向更好的趋势发展。

表4 31种碳源在第1、2主成分上的载荷值

大量研究表明，土壤中加入有机物料能够提高有机质含量及微生物群落多样性。不同腐熟水平的有机物料会造成土壤微生物的选择适应性，出现一些种群富集而一些种群数量降低的现象，进而导致微生物对碳源的利用能力出现显著差异[16-18]。利用BIOLOG ECO微平板法进行功能多样性研究的结果表明，竹荪间作增强了橡胶园土壤微生物对碳源的代谢活性，同时提高了土壤微生物碳源利用的多样性。主成分分析结果表明，间作前后，土壤微生物碳源利用特征出现分异，结合微生物对6类碳源的相对利用率发现，这种差异可能是羧酸类、酚酸类、多聚物类和碳水化合物类碳源引起的。在整个过程中，以橡胶木屑为主要成分的栽培料经过分解，使土壤中各类碳源得到积累，微生物大量繁殖，碳源利用率升高，其中碳水化合物和羧酸类物质为土壤微生物的主要碳源，碳水化合物类碳源相对利用率最高。氨基酸是土壤最大的有机氮库，有机物料的施入可诱导土壤微生物对氨基酸类碳源的利用[19]，这与本研究中竹荪菌糠的作用结果一致，主要原因在于竹荪菌丝体和子实体含有丰富的氨基酸；酚酸类物质对植物生长有抑制作用，可由植物残体和凋落物降解产生，积累到一定水平时会对目标植物产生毒性[20-22]，在本研究中，虽然种植后酚酸类碳源相对利用率极显著升高，但仅约为20%，毒性作用有限。

有研究表明，气候变化可引起微生物群落结构变化并对微生物活动产生较大影响[23]。海南岛属热带季风气候，5—10月为雨季。竹荪采收在雨季前完成，采收时，气候对土壤微生物特性的影响有限。然而采后3个月进入雨季，与采收时相比，温度升高，土壤含水量增加，菌糠分解加速，微生物生长代谢加快，橡胶园土壤微生物量、微生物碳源代谢活性和多样性在间作模式和气候的共同影响下得到进一步提高。

综上所述，本研究运用培养法和BIOLOG ECO微平板法分析竹荪间作对橡胶园土壤微生物特性的影响，研究表明，竹荪间作可提高橡胶园土壤有益微生物数量、微生物碳源代谢活性和多样性，促进土壤养分循环和肥力提升。土壤微生物作为土壤肥力的重要指标，其测定结果在一定程度上可以反映竹荪间作对橡胶园土壤的改良效果，但土壤肥力是土壤物理、化学、生物特性的综合表现，结合物理、化学性质进行相关分析将有助于进一步揭示“橡胶-竹荪”胶菌循环经济模式对橡胶园土壤改良的效果。

4 结论

(1)间作竹荪可促进橡胶园土壤有益微生物生长繁殖，改变微生物区系，提高土壤肥力。

(2)间作竹荪后，橡胶园土壤微生物群落AWCD值、Simpson-Wiener指数、Shannon指数和McIntosh指数显著增加，微生物碳源代谢活性和多样性提高。

(3)橡胶园土壤微生物利用的碳源主要是碳水化合物和氨基酸类，其次为羧酸和多聚物类，酚酸和胺类的利用率较低。

(4)间作竹荪后，橡胶园土壤微生物碳源利用特征出现分异，在分异中起主要作用的是羧酸类、酚酸类、多聚物类和碳水化合物类碳源。