提高牛体外性控胚胎效率关键技术研究

佟桂芝，韩永胜，王洪宝，李信涛，王伟霞，宋 斌，李玉龙

（1.黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161005；2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130000）

国外采用性控冷冻精液进行体外性控胚胎生产的研究较早，目前囊胚率能达到50%左右[1-2]。我国在该项领域的研究起步较晚，但国内学者通过不断改善优化牛体外性控胚胎的生产体系，目前我国的体外受精囊胚率已达到25%左右[3-5]。针对牛良种快速扩繁的实际需求及采用性控冷冻精液体外受精生产性控胚胎效率较低、成本较高的现状，该试验系统地比较了性控精液体外获能方法、获能液及体外受精液添加抗坏血酸、卵母细胞周围卵丘细胞部分脱除对性控精液体外受精性控胚胎发育率的影响，进而为提高体外性控牛胚胎生产效率提供技术基础。该试验以牛体外受精性控胚胎为研究对象，在体外受精的过程中添加抗坏血酸，统计性控胚胎的体外受精卵裂率、囊胚率，旨在证明抗氧化剂在提高牛性控冻精体外受精早期胚胎发育中的功能。

表1 精子不同体外获能方法对体外受精效果的影响

1 材料与方法

1.1 主要试剂

试验中所涉及的生化试剂除特别标注外均购自Sigma公司。

1.2 卵母细胞的收集

在牛屠宰场，用无菌剪刀剪取刚屠宰后牛的新鲜卵巢，用含1 000 IU/L青霉素和1 000 IU/L链霉素的灭菌生理盐水冲洗干净，放入含有双抗的32℃生理盐水中，在2 h内送回实验室。用无菌剪刀剪掉周围的脂肪等组织后用预热加有双抗的生理盐水冲洗牛卵巢3次以上，用10 mL的带有12#针头的一次性注射器抽取卵巢上直径为2～8 mm卵泡的卵泡液，获得的卵泡液置于15mL离心管内。放在预热至38.5℃的恒温台。分别取直径3.5 cm培养皿4个、直径9 cm培养皿2个，将直径9 cm的培养皿底部划上宽度间隔约为0.7 cm的直线。将含有COCs的采卵液（15 mL离心管内）倒入培养皿中，并轻轻摇匀。然后在体视显微镜下收集卵丘—卵母细胞复合体 （cumulus oocyte complex，COCs），并移入盛有抽卵液的直径3.5 cm培养皿中。形态正常、胞质均匀和卵丘细胞不低于3层的COCs为可用。用预平衡的卵母细胞成熟液清洗5次。采卵液配方：mPBS（0.665 g/L肝素钠、10%FBS、100 IU/L 青霉素、100 IU/L 链霉素）。

1.3 卵母细胞体外成熟

在体视镜下检出卵母细胞，然后选出A、B级卵母细胞，放入在培养箱预平衡2 h以上，4孔培养板进行体外成熟（500 μL/孔），每孔放50枚A、B级卵丘—卵母细胞 （COCs）。成熟液TCM-199[10 μg/mL 促性腺激素（FSH）、8% 胎牛血清（FCS）、1 μg/mL 雌二醇（E2）、1 μg/mL 促黄体激素（LH）、1 mmol/L L-谷氨酰胺、20 ng/mL EGF、100 μmol/L半胱氨酸]，体外成熟24 h。培养条件为38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱。

1.4 精子获能及体外受精

1.4.1 精子离心体外获能法：牛性控冷冻精液在38℃水浴中解冻15 s，然后将解冻后的精液贴壁缓慢加入获能液，然后进行离心（2 000 r/min，5 min），一次离心体外获能法在此时去上清液后，直接用受精液将精子密度稀释至1×106个/mL用于体外受精，二次离心体外获能法离心沉淀后的精子团用 5 mL获能液（1 000 r/min，5 min）再离心 1次。去上清液后，用受精液将精子密度稀释至1×106个/mL用于体外受精。性控精子体外获能液BO液：10 mg/L 咖啡因、5 μmol/L 抗坏血酸、3 mg/mL BSA。

1.4.2 精子上浮获能法：用加样器枪头轻轻把解冻后的精液贴壁加入离心管底部的获能液中，然后把离心管放入培养箱上浮30 min进行体外获能。性控精子体外获能液BO液：0.665 g/L肝素钠、50 mol/L抗坏血酸、3 mg/mL BSA。

1.4.3 部分脱除卵丘细胞：体外成熟后的卵母细胞用0.1%的透明质酸酶处理3 min，部分脱除卵丘细胞，卵母细胞外仍然保留1～3层的卵丘细胞，这样有利于性控精液的穿卵过程。

1.4.4 体外受精：受精前2 h做好受精液小滴，每滴50μL，放入CO2培养箱中平衡。在精子处理的同时，用200 μL移液器反复吹打培养成熟的COCs。使卵子间相互分离。洗涤5次后，将20个COCs移入受精液滴中。然后将培养皿放入38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行体外受精。体外受精液BO液：0.665 g/L肝素钠、10 mg/L咖啡因、5 μmol/L 抗坏血酸、3 mg/mL BSA。

1.5 体外胚胎发育培养（IVC）

1.5.1 胚胎发育液预平衡：在4孔培养板上标记组别、日期，每孔放入胚胎发育培养Ⅰ液600 μL，覆盖石蜡油。另取1.5 mL离心管，吸取1 mL的胚胎发育培养Ⅰ液放入离心管中，做好标记。将4孔培养板和离心管放入38.5℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中，预平衡2 h。mCR1aa：2%的必需氨基酸、1%的非必需氨基酸、2 mmol/L的谷氨酰胺；胚胎发育培养Ⅰ液：mCR1aa液+3 mg/mL BSA。

表2 获能液和体外受精液添加抗坏血酸对体外受精效果的影响

表3 部分脱除卵丘细胞对牛体外受精性控胚胎发育的影响

然后在胚胎发育培养Ⅰ液（预先在培养箱内平衡2 h）中洗涤3次后，然后按每滴50个卵子移入500 μL 的 IVC 液 4 孔培养板中，在 5%O2、5%CO2、90%N2，饱和湿度条件下进行早期胚胎体外培养。

1.5.2 更换培养液：受精卵于受精48 h统计卵裂率后转移至600 μL的胚胎发育培养Ⅱ液中继续培养，间隔2 d半量换胚胎发育培养Ⅱ液。4孔培养板放入 38.5 ℃、饱和湿度的 5%O2、5%CO2、90%N2培养箱中培养。于受精第7～8天统计囊胚率。胚胎发育培养Ⅱ液配方：mCR1aa液+10%FBS。

1.6 数据处理

试验重复3次，试验数据用Excel 2003软件建立数据库进行数据整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 精子不同体外获能方法对体外受精效果的影响

性控冷冻精液解冻后按照3种不同的方法进行精子体外获能，然后按常规程序进行体外受精和早期胚胎体外培养。由表1可知，精子上浮获能法体外受精卵裂率、囊胚率均显著高于二次离心体外获能法（P＜0.05），但与一次离心体外获能法无显著差异（P＞0.05）。

2.2 获能液和体外受精液添加抗坏血酸对体外受精效果的影响

由表2可知，性控冷冻解冻精子获能液和体外受精液添加1.0%抗坏血酸组体外受精卵裂率、囊胚率显著高于不添加抗氧化剂组体外受精卵裂率、囊胚率（P＜0.05），但添加0.5%抗坏血酸组及添加1.5%抗坏血酸组与不添加组差异不显著 （P＞0.05）。

2.3 成熟卵母细胞周围的卵丘细胞是否部分脱除及对牛体外受精性控胚胎发育的影响

由表3可知，体外成熟培养24 h卵母细胞周围的卵丘细胞脱除情况分为部分脱除组和不脱除组，当卵母细胞周围的卵丘细胞部分脱除时，经性控冷冻精液体外受精后的体外受精卵裂率、囊胚率均显著高于不脱除组的体外受精卵裂率、囊胚率（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 性控精子不同获能方法对体外受精效果的影响

性控冷冻精液解冻后按照3种不同的方法进行体外获能，然后按常规程序进行体外受精和体外培养。上浮获能法体外受精卵裂率、囊胚率均显著高于二次离心体外获能法（P＜0.05）。一次离心体外获能法体外受精卵裂率、囊胚率和精子上浮获能法无显著差异（P＞0.05），但显著高于二次离心体外获能法（P＜0.05）。该结果与常规冷冻精液试验结果不同[6]。性控冷冻精子在X、Y精子分离过程中活力受到显著降低，所以性控冷冻精液更适合采用精子上浮获能法或一次离心体外获能法，而普通精液的体外获能方法更适合采用二次离心体外获能法。

3.2 精子获能液和体外受精液添加抗坏血酸对体外受精效果的影响

该试验结果表明，获能液和体外受精液添加抗坏血酸组体外受精卵裂率、囊胚率显著高于不添加组（P＜0.05）。性控冷冻精液在制备过程中，由于精子长时间暴露于体外，外界环境因素刺激造成了精子氧化应激产生大量活性氧簇（ROS）[7]，死亡的精子释放大量的ROS[8]，精子分选时除去富含抗氧化物质的精浆，使得过多的ROS无法及时清除[9]。近年来，有研究发现在精液冷冻前稀释液中添加一定量的白藜芦醇等抗氧化剂，可降低羊[10]、牛[11]的精液冷冻过程中ROS对精子DNA的损伤，保护精子染色质，降低精子冷冻保存诱导的氧化损伤[12]。这些氧化损伤会降低精子顶体反应能力及卵母细胞融合能力，最终影响体外受精能力[13]。性控冷冻精液经过染色和长时间的体外分离及冷冻过程，精子体内产生了较多的过氧化物，对于性控精子在进行体外获能、体外受精过程中通过添加抗氧化剂来降低氧化应激水平，提高精子体外受精效果的研究并没有人进行试验。该试验证明了性控冷冻精液在体外获能及体外受精液中添加抗氧化剂能够降低由于氧化应激反应产生的ROS对活力较弱的性控精子的危害。

抗坏血酸具有亲水性，可捕获液相中游离的ROS，是精浆中可抵抗ROS对精子毒性的重要抗氧化物质，可缓解氧应激造成的损伤。有研究表明，将其作为抗氧化剂在精液冷冻保存中有着重要的应用[14-16]。在精液稀释液中添加抗坏血酸，能够有效提高人、猪、牛精液的抗氧化性，降低DNA的氧化损伤，提高冷冻保存精子的运动性、膜完整性、顶体反应能力，对于提高冷冻精液的受精能力有重要意义[17-19]。但对于将其作为体外性控胚胎生产过程中性控精子体外受精上的使用并未见报道。

3.3 体外受精前部分脱除卵丘细胞对体外性控胚胎发育的影响

在体外受精前，成熟卵母细胞周围的卵丘细胞脱除情况为部分脱除组体外受精卵裂率显著高于不脱除组（P＜0.05）。卵丘细胞在牛卵母细胞体外受精过程中有着许多重要作用，其中包括吸引、阻绊和选择精子[15]，活力弱的精子在其阻绊下一般很难接近卵母细胞。在该试验中，COCs体外成熟培养之后采用性控精液直接进行体外受精，其体外受精卵裂率显著低于卵丘细胞部分脱除组（P＜0.05），这表明卵丘细胞显著影响了性控精液对卵母细胞的受精能力。 Gao 等[20]、Khurana 等[21]研究都表明性控精液在体外受精过程中精子活力下降要显著快于常规精液，因而卵母细胞周围的卵丘细胞可能会阻挡活力不断下降的性控精子与卵母细胞的受精，卵丘细胞部分脱除则可有效解决上述问题，这也是解释该试验结果的一个原因。

4 结论

性控冷冻精子体外获能采用一次离心体外获能法或上浮获能法精子获能液和体外受精液宜添加抗坏血酸；成熟卵母细胞体外受精前部分脱除卵丘细胞，能够提高性控精子体外受精率以达到体外高效生产牛体外性控胚胎的目的。