响应面法优化白刺花总黄酮提取工艺研究

红河卫生职业学院，云南 蒙自 661199

白刺花又名苦豆花、白花，为豆科小灌木植物，在南方各地的山坡、田埂及丘陵地带均有大量分布，有的荒地上甚至成为其主要的植被分布[1]。云南多数地区有食用其花的习俗，为云南红河州彝族、白族、苗族、哈尼族等少数民族习用[2]。白刺花具有清热利湿、消积通便、杀虫止痒的功效，用于腹痛腹胀、食积虫积、痢疾；带下阴痒；疥癞疮癣[3]；其花有清热解暑作用，可用于暑热烦渴等[4]。当地百姓用其泡茶饮用，在降脂降糖上具有一定效果，但未见文献报道白刺花有降血脂及降血糖的作用。白刺花含黄酮及生物碱，有抗炎、抗过敏的作用[5]。基于白刺花的各种优势特点，笔者欲将野生白刺花的叶、花开发为保健速溶茶，通过试验研究，优化出白刺花总黄酮的最佳提取方法，为白刺花保健速溶茶的开发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 A580型双光束紫外可见分光光度计(翱艺仪器有限公司) ；ML204分析天平(上海亚荣仪器有限公司)；FA2004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司) ；101型电热鼓风干燥箱北京市永光明医疗仪器有限公司) ；HH-4 型恒温水浴锅(常州润华电器有限公司) ；DLF-18型流水式中药粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司) ；RE-3000A 型旋转蒸发器(上海亚荣仪器有限公司) 。

1.2 材料 芦丁对照品(批号:20160427，上海金穗生物科技有限公司) ；白刺花采自红河州豆科小灌木植物白刺花的花；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠均为分析纯，购于天津市致远化学有限公司。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备[6]精密称取干燥的芦丁对照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇适量，至水浴锅上微热使芦丁溶解，冷却后，在甲醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含芦丁0.2 mg的对照品溶液。

2.1.2 测定波长的选择 取对照品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液1 mL摇匀，再放置6 min，加1 mol / L氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，于波长400～600 nm 范围内扫描，500 nm波长处有一最大吸收峰，故选择500 nm为测定波长。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分别置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”项下方法，选择500 nm波长，用相应的试剂作空白，测定每种溶液的吸光度，以吸光度Y做横坐标，浓度X做纵坐标，绘制标准曲线，见表1及图1。回归方程得Y= 21.725X-0.0012，r2=0.9998，结果显示，芦丁在 0.008～0.04 mg/mL内具有良好线性关系。

表1 芦丁对照品线性关系考察表

2.1.4 供试品溶液的制备 将白刺花原料粉碎，过60目筛，按实验设定的条件进行提取，提取液减压抽滤，滤液定容，即得供试品溶液。

2.1.5 样品中总黄酮的含量测定 精密量取2 mL供试品溶液置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”项方法测定吸光度，计算总黄酮提取率。

式中:C 为提取总黄酮的质量浓度，mg/mL；V1 为测量液定容体积，25 mL；V2为测量时量取的体积，2 mL；V3为提取液定容体积，100 mL；m为称取样品的质量，5000 mg。

2.2 单因素考察

2.2.1 加液量对白刺花中总黄酮提取率的影响 固定乙醇浓度60%，提取时间1.5 h，提取温度 80 ℃ 等实验因素，考查5、10、15、20、25倍加液量下总黄酮的变化。由图2可知，在加液量为20倍以前，白刺花总黄酮的提取率随加液量倍数的增大而增大，但加液量达到20倍后，总黄酮的提取率呈下降趋势，即20倍的加液量的提取率达到高峰，因此加液量为20倍时较为合适。20倍加液量后总黄酮提取率呈下降趋势可能是溶剂体积较大，非黄酮类成分溶解度增大而大量溶出，从而导致白刺花的总黄酮提取率的下降。

2.2.2 提取时间对白刺花中总黄酮提取率的影响 固定加液量为20倍，乙醇浓度为 60% ，提取温度为 80 ℃等试验因素，考察提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h时白刺花中总黄酮的提取率。由图3可知，在提取时间为2 h 时白刺花总黄酮提取率最高，继续延长提取时间，提取率会降低，在提取时间为3 h时提取率最低，故选提取时间为2 h为最优提取时间。图上还反应出提取时间太长，都会使白刺花中总黄酮被破坏，以致提取率下降。

2.2.3 乙醇浓度对白刺花中总黄酮提取率的影响 固定加液量为20倍，提取时间为2 h，提取温度为80 ℃，考查乙醇浓度分别为40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇时白刺花中总黄酮的提取率。由图4可知，随着乙醇浓度加大，提取液的极性越接近提取物的极性，提取率不断提高，当乙醇浓度为70%时，白刺花中总黄酮的提取率达到最高，70%后再增大乙醇浓度提取率将降低，是因为乙醇浓度太高，白刺花中醇溶性杂质及色素等成分溶出增多。因此70%的乙醇浓度为最优乙醇浓度。

2.2.4 提取温度对白刺花中总黄酮提取率的影响 固定加液量为20倍，提取时间2 h，乙醇浓度为70%等实验因素，考查提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃时白刺花中总黄酮的提取率。由图5可知，温度升高，提取率在增高，当温度达到70 ℃ 时，白刺花中总黄酮提取率最高，当温度增大到80 ℃时，总黄酮提取率有所下降，当温度增大到90 ℃时，总黄酮提取率下降明显。因此选择温度为70 ℃为白刺花总黄酮提取最优温度。

2.3 响应面法优化白刺花中总黄酮提取工艺 在单因素试验的基础上，选择乙醇浓度(A)、加液量(B)、提取温度(C) 和提取时间(D),利用 Design-Expert 8.0.6软件中的 Box-Behnken 软件优化白刺花中总黄酮提取条件。以白刺花总黄酮提取率为响应值，进行响应面分析试验[7-8]，以 A、B、C、D 为自变量，以总黄酮提取率为响应值(Y) 进行实验设计，各因素水平设计见表2。白刺花Box-Behnken中心组合试验设计和结果见表3。

表2 白刺花中总黄酮提取响应面设计表

表3 白刺花Box-Behnken中心组合试验设计和结果

续表3表3 白刺花Box-Behnken中心组合试验设计和结果

采用Design-Expert 8.0.6软件分析试验结果，以总黄酮提取率为响应值，对实验数据进行二次多项式回归拟合，得回归方程为:

Y=0.92+0.018A+0.023B+7.500E-003C+0.035D+0.021AB-2.500E-003AC+0.016AD+0.034BC+7.750E-003BD-7.500E-003CD-0.093A2-0.075B2-0.043C2-0.043D2

使用Design-Expert 8.0.6软件回归分析对方程及各因子进行方差分析。由表4可知，以白刺花的总黄酮提取率为响应值，回归方程显著性检测P﹤0.0001，表明所得二次方程模型极显著，而失拟项的P值为0.9986，不显著，R2=0.9921，表明回归方程模型与实际实验拟合性比较好，实验误差较小，说明采用响应面法优化白刺花中总黄酮提取工艺是可行的，具有参考性[9]，其中各影响因素对白刺花总黄酮提取率的影响顺序为:提取时间>加液量>乙醇浓度> 提取温度。

表4 响应面法优化白刺花总黄酮提取率的方差分析表

续表4表4 响应面法优化白刺花总黄酮提取率的方差分析表

表4中一次项乙醇浓度、加液量、提取时间的P值都小于 0.0001，说明都对白刺花总黄酮的提取率有极显著的影响，提取温度的P值为0.0064，小于0.01，表明其对白刺花总黄酮的提取率有高度显著的影响; 交互项BC对白刺花总黄酮提取率的影响极显著，AD对白刺花中总黄酮提取率的影响高度显著，其余不显著; 二次项 A2、B2、C2、D2均达到极显水平说明各因素对白刺花中总黄酮的提取率存在交互影响，而不是简单的线性关系[10]

将表3中的试验结果进行响应面的曲面分析，在影响因素中选择其中两个交互的因素对白刺花中总黄酮的提取率的影响进行分析，把其他因素固定为零。根据回归方程，考察各影响因素响应曲面的形状，分析各因素对白刺花中总黄酮提取率的影响，结果如图6～11所示。

根据Design-Expert 8.0.6软件响应曲面优化原理，3D曲面图的坡度越大，说明响应值对于操作条件的改变影响越大; 反之曲面图坡度越小，操作条件改变对响应值的影响也就越小[11-12]。图 6～11反映了乙醇浓度、加液量、提取温度 和提取时间四个因素交互作用对白刺花中总黄酮提取率的影响，其中乙醇浓度及加液量(图6)、乙醇浓度及提取时间(图8)、提取温度及加液量(图9)交互作用3D曲面图坡度较大，表明这三组对白刺花中总黄酮提取率的交互作用明显。

通过响应面分析优化，用Design-Expert 8. 0. 6软件对回归方程进行计算，得到白刺花中总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度 71.59% ，加液量为21.15倍，提取温度为71.32 ℃，提取时间2.22 h；在此条件下模型预测总黄酮提取率为0.93118% 。考虑到在实际操作中，设备等各条件有限，对最佳工艺条件修正为:乙醇浓度 72% ，加液量为21倍，提取温度为71 ℃，提取时间为133 min。

2.4 验证实验 根据所修正的条件进行了3次平行验证试验，结果白刺花中总黄酮的平均提取率为0.9273%，与模型相对误差为0.42%，说明实验结果与模型拟合较好，利用响应面优化法优化所得到的提取工艺参数准确可靠。

3 讨论

白刺花中黄酮类化合物含量丰富，具有非常好的药用、食用、保健作用价值和开发利用前景。本研究以干燥的白刺花的花粗粉为原料，以乙醇为提取溶剂，在单因素试验基础上，用 Design-Expert 8.0.4 软件对白刺花提取工艺参数进行响应面试验优化。结果表明最佳的提取工艺条件为:乙醇浓度 72%，加液量为21倍，提取温度为71 ℃，提取时间为133 min。优化所得到的最佳提取工艺是提取白刺花中总黄酮的有效途径，为开发保健速溶茶提供可靠的依据。