40岁以上男性精子DNA损伤与其精液常规参数的关系分析

伍文兵 李文威

鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科, 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室（湖北黄石 435000）

不孕不育症诊断中，男性因素约占40%[1]，男性不育症与诸多因素相关，近年有关男性生育能力与年龄的关系得到关注，Sloter等[2]研究显示，男性子代染色体缺陷风险加大与年龄的增长密切相关；de la Rochebrochard等[3]发现，男性年龄越大，配偶自然流产风险越高；这可能与35岁以上健康男性精子DNA损伤水平增加有关[4]。目前有关男性不育的诊断，除无精子症可由指标确诊外，其他诊断技术相对匮乏，常规检测仅能通过精子活力、浓度、形态等常规精液参数评估，不能满足临床要求[5]。随着DNA完整性诊断技术发展，评估男性生育能力技术得以提升，其中双尾彗星试验是评估DNA完整性的方法之一，可通过9种彗星模型鉴别精液DNA损伤属于单链还是双链损伤情况，临床鉴别价值高[6]。本研究通过双尾彗星实验分析我院＞40岁男性精子DNA损伤与其精液常规参数的关系，为男性生育能力评估提供临床参考。

资料与方法

一、一般资料

收集本院308例20岁至55岁不育男性患者精液。不育症诊断标准：结婚同居≥1年，性生活正常，无任何避孕举措，配偶生殖能力正常，未育。纳入标准：临床诊断符合不育症诊断标准，确诊者；年龄20～55岁者；身体健康者；无遗传性疾病者；无睾丸、输精管、附睾等生殖器官异常或外伤者；无性功能障碍者；无其他器质性疾病者；无不良生活习惯者。排除标准：继发性不育者；伴有腮腺炎病史者；伴有隐睾症、精索静脉曲张、无精子症、泌尿生殖系统疾病、乳腺发育异常、阴毛发育异常等者；合并其他急慢性疾病者；不配合研究者。

二、方法

（一）精液标本收集

308例受检者取精液前2～7d禁欲，取样前排净小便，洗净双手，采用手淫法收集全部精液标本于无菌、干燥、洁净塑料采样容器内，后马上置于37℃恒温水浴箱中液化处理，同时记录所有受试者禁欲时间和精液量，液化处理完毕后立刻进行后续检测。

（二）精液常规和精子诱发顶体反应检查

依据第五版WHO相关操作[7]进行：（1）精子浓度、总活力、前向运动率检测：取液化后精子5μL，采用计算机辅助精液分析系统（CASA）（购自北京伟力新世纪科技发展有限公司，型号WLJY29000型）于带37℃加热载物台的显微镜下观察精子浓度、精子总活力、精子前向运动率；（2）精子形态学检测：制备精液涂片，涂片风干后，采用Diあ-Quik染色法（试剂盒购自 Baxter公司）于光学显微镜下分析精子形态，计算正常形态率；（3）精子诱发顶体反应检测：采用考马斯亮蓝染色法进行精子诱发顶体反应检测，于光学显微镜下观察荧光标记染色精子，计算顶体反应率。试验由2人同时检测2次，取平均值，对于检测结果偏倚≥10%的样本，重新检测分析。

（三）精液DNA损伤分析

采用双尾彗星实验（双向单细胞凝胶电泳法）检测308例受检者精液DNA损伤情况：先进行预处理，将预先处理好的新鲜液化精液经PBS稀释至1×106/mL浓度，取25μL稀释精液与50μL 1%的琼脂糖于37℃下充分混合，加入至凝胶玻片，4℃下冰浴5 min，保证其凝固，后经裂解、洗涤、解旋、中性凝胶电泳、碱性凝胶电泳、脱水干燥、染色等步骤处理完毕后，使用CASP软件于10×40倍荧光显微镜（购自 Olympus BX41 型）下观察精子DNA损伤情况和损伤类型，记录DNA碎片化指数（DFI）、精子单链损伤指数（SSB-DFI）、精子双链损伤指数（DSBDFI）、精子SSB占所有损伤精子比例（SSB-DFI/DFI）和精子DSB占所有损伤精子比例（DSB-DFI/DFI）。

三、观察指标

（1）观察不同年龄层不育男性精液参数与精子DNA总体损伤率（DFI值）；（2）以DFI值=30%为分界线，分析＞40岁不育男性不同精子损伤程度患者精液参数情况；（3）分析＞40岁不育男性DFI值与各精液参数的相关性；（4）记录＞40岁不育男性精子SSB-DFI/DFI和DSB-DFI/DFI比例，将SSB-DFI/DFI＞DSB-DFI/DFI者定为单链损伤比例高组，将SSBDFI/DFI＜DSB-DFI/DFI者定为双链损伤比例高祖，比较两组精液参数；（5）采用Pearson相关性分析法分析＞40岁不育男性DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值与各精液参数的相关性。

四、数据分析

结 果

一、＞40岁不育男性与同龄已育男性精液参数与精子DNA总体损伤率比较

＞40岁组不育男性精液总活力、前向运动率和顶体反应率显著低于＞40岁正常组，DFI值显著高于＞40岁已育组，差异具有统计学意义；两组精液量、精子浓度、精子正常形态率差异不具有统计学意义（P＞0.05），见表1。

二、＞40岁不育男性不同DFI值患者精液参数分析

＞40岁不育男性中，DFI值≤30%组精子浓度、总活力、精子正常形态率、前向运动率和顶体反应率均显著高于DFI＞30%组，差异具有统计学意义，见表2。

表1 不同年龄层不育男性精液参数与精子DNA总体损伤率比较（s）

表1 不同年龄层不育男性精液参数与精子DNA总体损伤率比较（s）

DFI(%)＞40岁已育组1202.94±1.4239.85±15.6437.42±7.853.83±2.3226.84±7.356.32±2.3428.63±11.65＞40岁不育组1483.09±1.3538.45±15.5335.33±6.343.81±2.6224.12±8.115.61±2.8832.54±13.54 t 0.8840.7322.4110.0092.8462.1792.501 P＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.01＜0.05＜0.05组别n 精液参数精液量(mL)浓度(×106/mL)总活力(%)正常形态率(%)前向运动率(%)顶体反应率(%)

表2 ＞40岁不育男性不同DFI值患者精液参数分析（s）

表2 ＞40岁不育男性不同DFI值患者精液参数分析（s）

组别n精液量(mL)浓度(×106/mL)总活力(%)正常形态率(%)前向运动率(%)顶体反应率(%)DFI≤30%1123.12±1.3741.54±16.2242.82±8.024.89±2.7131.11±9.027.84±3.11 DFI＞30%363.02±1.2835.02±12.5525.45±5.413.15±2.0222.55±6.254.12±2.15 t 0.3872.20712.1243.5455.2946.675 P＞0.05＜0.05＜0.001＜0.01＜0.001＜0.001

三、＞40岁不育男性DFI值与精液参数的相关性分析

＞40岁不育男性DFI值与精子浓度（r=-0.254, P=0.021）、总活力（r=-0.512, P＜0.01）、正常形态率（r=-0.321, P=0.002）、前向运动率（r=-0.492, P＜0.001）和顶体反应率（r=-0.385, P=0.013）呈显著负相关，而与精液量无明显相关性，见表3。

四、＞40岁不育男性不同精子DNA损伤类型比例患者精液参数分析

＞40岁不育男性精子单链损伤比例高组精子浓度、总活力、正常形态率、前向运动率和顶体反应率均显著高于双链损伤比例高组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 ＞40岁不育男性DFI值与精液参数的相关性分析

表4 ＞40岁不育男性不同精子DNA损伤类型比例患者精液参数分析（s）

表4 ＞40岁不育男性不同精子DNA损伤类型比例患者精液参数分析（s）

组别n精液量(mL)浓度(×106/mL)总活力(%)正常形态率(%)前向运动率(%)顶体反应率(%)单链损伤比例高1083.11±1.3647.12±17.8845.65±9.115.12±2.8833.15±8.877.91±2.98双链损伤比例高403.03±1.2535.58±15.7223.54±6.553.03±2.3121.68±7.024.09±2.02 t 0.3253.59814.0504.1227.3637.487 P＞0.05＜0.01＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

五、＞40岁不育男性DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值与精液参数的相关性分析

＞40岁不育男性DSB-DFI /DFI值与精子浓度（r= -0.467, P=0.015）、总活力（r =-0.623, P=0.005）、正常形态率（r= -0.384, P=0.028）、前向运动率（r =-0.612, P＜0.001）和顶体反应率（r= -0.454, P=0.008）均呈显著负相关；SSB-DFI /DFI与精液各参数无显著相关性（P＞0.05），见表5。

表5 ＞40岁不育男性DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值与精液参数的相关性分析

讨 论

环境改变、基因突变、染色体异常等均可影响精子的正常发育，引起精子鱼精蛋白缺乏、染色体包装异常、精子DNA碎片化等，造成精子DNA损伤，而DNA完整性是保证父系遗传物质传至后代的前提[8]。年龄与精子质量下滑密切相关，高龄男性精子多存在基因缺陷和染色体异常概率增加现象，且随着男性年龄的增加，不育者附睾内氧自由基和睾丸生精过程DNA损伤修复能力下降，增加精子损伤与凋亡风险[9, 10]。Eskenazi等[11]报道称，男性的精液量、活性和浓度随年龄上升而下降，而精子活力则在40岁以后明显下降。有关年龄对不育男性精液质量的影响，已有诸多报道，而单纯分析40岁以上男性精子DNA损伤与其精液常规参数的关系的报道鲜见。本文通过CASA系统和双尾彗星实验检测40岁以上不育男性和同龄已育男性常规精液参数及精子DNA损伤情况发现，＞40岁不育男性精液总活动率、前向运动率和顶体反应率均显著低于同龄已育男性，DNA损伤程度也更为严重，说明40岁以上不育男性精液质量下降程度较同龄已育男性严重，具体分析相关参数发现，可能与精子DNA碎片化损伤和DNA损伤类型有关。

DNA碎片化指数（DFI）是评估男性生育功能的重要指标，Evenson等[12]分析精子染色体结构参数发现，DFI值与男性生育力呈负相关，当DFI值处于0～15%时，生育力高；当DFI值为16%～29%时，生育力中等；当DFI≥30%时，生育力低；而当DFI≥80%时，生育力无。本文以DFI=30%为分界线，分析＞40岁不育男性精液参数发现，DFI值≤30%组精子浓度、总活力、正常形态率、前向运动率和顶体反应率均显著高于DFI＞30%组，且DFI值与精子浓度、总活力、正常形态率、前向运动率和顶体反应率呈显著负相关，说明精液DFI对＞40岁不育男性生育能力具有一定评估作用，推测可能与精子发育、成熟期间低程度氧自由基反应、精子蛋白成分改变、精子线粒体代谢功能下降等诸多因素所致。Agarwal等[13]证实，低程度氧自由基反应可增加精子DNA损伤和精子高激活运动，降低精子活动率；Sergerie等[14]报道称，精子核鱼精蛋白下降与DFI值上升密切相关，核鱼精蛋白中P1/P2比例的下降，可明显抑制二硫键生成，造成染色体结构松散，增加精子DNA损伤和影响精子DNA完整性，影响精子正常活力和形态；此外，精子线粒体代谢功能下降，不仅可以加重DNA损伤，还可影响精子活力[15]；上述共同因素均可影响精子活力和DNA完整性。

精子DNA损伤类型，包含单链与双链损伤，而精子DNA单链损伤属于精子遗传物质加工、包装期间自然产物，而双链损伤才是造成男性不育的决定性因素[16]。精子DNA双链损伤后，其双螺旋结构被破坏，损伤难以修复，而精子DNA单链损伤后，其双螺旋结构依然存在，不会造成遗传物质和结构丢失，依然可以自行修复[17]。本文采用可辨别精子DNA损伤类型的双尾彗星试验评估DNA完整性发现，＞40岁不育男性精子单链损伤比例高组精子浓度、总活力、正常形态率、前向运动率和顶体反应率均显著高于双链损伤比例高组，说明精子DNA双链损伤对生育能力的影响更大，与上述报道具有一致性。通过分析＞40岁不育男性精液DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值与精液参数关系发现，DSB-DFI /DFI值与精子浓度、总活力、正常形态率、前向运动率和顶体反应率呈显著负相关，而SSB-DFI /DFI与精液各参数无显著相关性，说明精子DNA双链损伤可直接评估患者生育能力，是导致少弱精子症的重要因素，而单链损伤并非是精子质量的决定因素，与魏任雄等[6]报道结果一致。不育症诊断中，DNA完整性检测逐步应用于临床评估，利于极大提高不育症诊断率。本文虽然具体分析了40岁以上不育男性精子DNA损伤与其精液常规参数的关系，得出DFI值和双链损伤对其生殖情况具有一定评估价值，但相关机制和深入原因并未进一步分析，且未针对低龄不育人群进行分析，存在一定不足，后期需进一步深化。

综上所述， ＞40岁不育男性精液参数异常和DNA损伤情况较同龄已育男性严重，精液DNA碎片化指数和双链损伤类型对40岁以上不育男性生殖情况评估参考价值更高。