热休克蛋白75/78在叔丁基双氧水诱导HEI-OC1毛细胞株凋亡中的作用*

张菲玲 夏云 姚裕恒 王军义

耳蜗毛细胞凋亡是多种感音性聋(噪声暴露、电离辐射、药物毒性等)的重要病理学过程[1]，氧化应激反应产生大量氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是诱发耳蜗毛细胞凋亡的最主要因素[1，2]，ROS通过激活多种信号转导通路调节细胞相关基因转录诱发毛细胞凋亡是目前的主要观点[3]；热休克蛋白75(glucose regulated protein 75，GRP75，又名热休克蛋白A9，HSPA9)和热休克蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78，又名热休克蛋白A5，HSPA5)均属于热休克蛋白70家族成员，这二种蛋白具有重要的生物学功能，生理情况下主要作为分子伴侣参与蛋白质合成后的修饰、折叠和转运等过程，但在细胞受到各种刺激时的应激反应和恶性肿瘤细胞中，GRP75、GRP78与细胞的增殖和凋亡过程密切相关[4～7]，但其机制尚不十分清楚，尤其在内耳毛细胞凋亡机制研究中尚无GRP75、GRP78的相关报道。本研究拟通过检测体外培养毛细胞并应用叔丁基双氧水诱导制作的氧化应激损伤凋亡模型[8，9]的GRP75、GRP78表达水平，分析其在毛细胞凋亡中的可能作用，为研究感音性聋毛细胞凋亡机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1毛细胞株 采用美国House研究所(House Ear Institute，HEI)提供的HEI-OC1毛细胞株，该细胞株从永生化小鼠耳蜗Corti器分离培育，并能在体外稳定传代培养。

1.2仪器和试剂 70%叔丁基双氧水(tert-Butyl hydroperoxide,t-BHP)(南京化学试剂公司，中国)，胎牛血清(HyClone，美国)，DMEM 培养液(HyClone，美国)，Caspase-3兔单克隆抗体(CST，美国)，GAPDH兔单克隆抗体(Proteintech，美国)，Western细胞裂解液(Proteinsimple，美国)，Anti-Rabbit Detection Module for Wes试剂盒(Proteinsimple，美国)，12-230kDa Wes Separation Module试剂盒(Proteinsimple，美国)，TRNzol Universal总RNA提取试剂(天根生化科技公司，中国)，Fermentas反转录试剂盒K1622(MBI Fermentas，美国)，Fermentas K0223 qPCR试剂盒(MBI Fermentas，美国)，引物设计合成(广州赛哲生物公司，中国)，BPX-82型恒温培养箱(上海博讯实业公司，中国), Wes型全自动Western blot分析仪(Proteinsimple，美国)，ABI Stepone Plus型荧光定量PCR仪(ABI，美国)。

1.3实验方法

1.3.1毛细胞t-BHP染毒[8,9]取正常生长的HEI-OC1毛细胞置于含 10%胎牛血清的DMEM 培养液中，在33 ℃、10% CO2条件下培养，细胞浓度为106个/ml。用培养液将70% t-BHP稀释制备成20、40、60 μM浓度，去除各细胞培养孔的培养液，分别加入200 μl含20、40、60 μMt-BHP的培养液，对照孔加入200 μl无药物培养液，6复孔培养24小时后进行GRP75/GRP78 mRNA、Caspase-3、Active-Caspase-3蛋白检测。

1.3.2Western blot检测各组HEI-OCI细胞中Caspase-3、Active-Caspase-3的表达 对上述各样本加入80 μl细胞裂解液冰上裂解10 min，6 000 rmp、5 min离心后收集上清蛋白液用Wes仪进行Western blot检测，样品处理严格按照试剂盒Anti-Rabbit Detection Module for Wes和12-230kDa Wes Separation Module的操作步骤，反应参数为：分离胶吸取200 s、浓缩胶吸取15 s、吸样9 s、电泳25 min(恒压375 V)、凝胶清除230 s、洗涤3次(每次150 s)、封闭5min、抗Caspase-3或抗GAPDH(内参)孵育30 min、二抗孵育30 min、发光液曝光50 s。实验结果显示各样品的灰度值，由于Caspase-3正常以酶原(32 KD)形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(Active-Caspase-3，17 KD)和两个小亚基(12 KD)组成，以GAPDH为内参计算Caspase-3(32 KD)和Active-Caspase-3(17 KD)的相对灰度值分别表示其表达水平。

1.3.3实时荧光定量PCR检测GRP75、GRP78 mRNA的表达 培养的各组细胞PBS洗涤后加1 ml TRNzol Universal裂解细胞，分别加入200 μl氯仿，混匀静置5 min，12 000 rpm、4 ℃离心15 min，取上清加入异丙醇500 μl，混匀后室温静置10 min，12 000 rpm、4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 ml 70%乙醇，7 500 rpm、4 ℃离心5 min弃上清，加30 μl DEPC水溶解沉淀，取少量进行检测，逆转录反应严格按照Fermentas K1622试剂盒操作说明，实时荧光定量PCR反应于ABI Stepone Plus PCR仪中进行，反应严格按照Fermentas K0223试剂盒操作说明。反应条件为：95 ℃、10 min预变性，按95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s共做40个循环，最后95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s 1次。应用2-△△Ct法对GRP75/GRP78 mRNA和GAPDHmRNA(GAPDH mRNA为内参基因)表达进行相对定量检测，每组细胞每个基因至少重复6次；引物设计合成序列参见表1。

表1 GRP75/GRP78和GAPDH基因引物序列

2 结果

2.1各组HEI-OC1细胞中Caspase-3、Active-Caspase-3蛋白表达 Western-blot检测各组HEI-OC1细胞Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表达水平见表2和图1，与对照组相比，各染毒组Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表达水平显著增高(F=1 196.741,P<0.001和F=184.131,P<0.001)，40 μM和60 μM染毒组Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表达水平显著高于20 μM染毒组(P<0.01)，40 μM和60 μM染毒组之间差异无统计学意义(P>0.05)。对照组正常HEI-OC1细胞几乎不表达Caspase-3、Active-Caspase-3，凋亡细胞中二者表达水平显著增加，且Active-Caspase-3表达水平远低于Caspase-3。

表2 各组Caspase-3、Active-Caspase-3、GRP75/78 mRNA表达水平比较±s)

图1 Western-blot检测各组HEI-OCl细胞中Caspase-3、Ac-tive-Caspase-3表达

2.2各组HEI-OC1细胞中GRP75、GRP78 mRNA的表达 实时荧光定量PCR检测各组HEI-OC1细胞GRP75、GRP78 mRNA表达水平见表2，与对照组相比较，各染毒组GRP75、GRP78 mRNA表达水平显著增高(F=228.065,P<0.001和F=1 298.057,P<0.001)，40 μM和60 μM染毒组GRP75、GRP78 mRNA的表达水平显著高于20 μM染毒组(P<0.01)，但40 μM与60 μM染毒组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

Caspase-3是细胞凋亡过程的重要执行因子，正常以酶原形式存在于胞浆中并无催化活性，Active-Caspase-3由二个大亚基(17 KD)和二个小亚基(12 KD)组成，通过裂解胞浆、胞核底物导致细胞凋亡，所以Caspase-3和Active-Caspase-3也可认为是细胞凋亡的重要标志物。本研究发现t-BHP染毒的HEI-OC1细胞Caspase-3和Active-Caspase-3表达水平较对照组显著升高，在一定程度上代表了细胞凋亡水平，但高浓度(40 μM和60 μM)染毒组之间氧化损伤严重的HEI-OC1细胞中Caspase-3和Active-Caspase-3表达水平并没有随着氧化损伤的加重而增高，GRP75和GRP78的检测结果与此类似，提示GRP75和GRP78与细胞凋亡密切相关。

GRP78是定位于内质网的结合蛋白，参与合成蛋白质的折叠与转运，也是细胞内重要的应激蛋白，与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)密切相关，ERS是指细胞受到应激反应时发生内质网折叠蛋白异常，导致错误蛋白在内质网内堆积，进而激活促凋亡因子诱发细胞凋亡的发生[10,11]。ERS凋亡途径是通过多个下游因子激活Caspase-12，进而激活凋亡执行蛋白Caspase-3促进凋亡发生[12,13]。ERS发生时GRP78表达水平升高，GRP78通过重新折叠错误的蛋白质达到维持内质网稳定、保护细胞的作用[14]，目前尚无证据说明GRP78与细胞凋亡的直接关系，但研究发现通过沉默GRP78的表达可促进细胞凋亡的发生，GRP78的过表达可以减轻细胞的凋亡[15，16]，推测其机制可能与GRP78修复内质网内错误折叠蛋白质的功能相关，因为错误折叠蛋白的堆积是诱发ERS凋亡途径的最主要因素。本研究发现氧化应激损伤的HEI-OC1毛细胞中GRP78高表达，而应激损伤严重组GRP78表达水平不再升高，这与凋亡蛋白Caspase-3、Active-Caspase-3表达特征相似，说明GRP78参与了毛细胞的凋亡过程，推测其可能通过缓解ERS凋亡途径发挥抗凋亡的作用。

GRP75是高度保守的应激蛋白，尽管分布于多处亚细胞结构，但其主要定位于线粒体中，在应激刺激(ROS、电离辐射、毒物等)下表达水平增高，具有保护细胞的生物学功能[17]。GRP75具有抗凋亡的生物学效应[18]，其机制复杂，目前尚存争议，主要有以下几种观点：第一、GRP75能抑制氧化应激反应中线粒体细胞色素酶C(Cyt-c)释放至胞浆，Cyt-c在线粒体内可以抑制ROS的积累，而胞浆中的Cyt-c可激活Caspase-9、Caspase-7、Caspase-3诱发凋亡[19]；第二、GRP75可与P53蛋白结合，阻止P53入核激活凋亡基因Bax、Noxa、PUMA的表达[16];第三、GRP75可通过Raf/Mek/Erk1/2信号通路促进Bcl-2的表达、抑制Cyt-c的释放抑制凋亡发生[20]。本研究发现氧化应激损伤的HEI-OC1细胞中GRP75表达水平反应性增高，是对细胞凋亡的应激反应，而且其表达特征与Caspase-3、Active-Caspase-3相似，符合GRP78抗凋亡机制。可见，尽管GRP75和GRP78都属于同一家族的应激蛋白，结构和功能有相似的部分，都具有抗氧化、抗凋亡的生物学效应，但其机制不同。

综上所述，氧化应激损伤的HEI-OC1细胞中GRP75和GRP78出现反应性高表达，其生物学作用是抗凋亡保护细胞，但其具体的作用及机制尚有待于进一步研究证实。