人参总皂苷对大鼠急性心肌梗死模型血管新生及心功能的影响研究

（云南省临沧市农业学校，云南临沧 677000）

急性心肌梗死（AMI）是世界范围内有着有着较高致残甚至致死率的疾病类型。现阶段，在临床中，多采用手术、介入、药物等方式治疗AMI，但无论采用何种方式，其治疗目的无外乎是抑制心律失常，改善心肌缺氧、缺血，使心脏灌注始终处于良好状态[1]。虽然有着比较多的治疗方案，但其中的大部分治疗方法，均难以实现对梗死的心肌等进行有效修复。针对由AMI所引起的自发性血管新生反应而言，其实为一个比较典型的带有慢性、保护性特点的反应过程，仅能对阻塞冠脉下的心肌进行部分补充，而难以达到完全修复[2]。针对人参等中药材而言，其经常被用作心脑血管疾病、糖尿病、肝肺纤维化等的预防与治疗。人参当中含有丰富的黄酮、糖、皂苷等，而主要活性成分为皂苷。人参总皂苷（TG）包含40多种皂苷单体（Rb1、Rg1等），其中，Rb1等对心肌细胞凋亡有抑制作用，还能使内皮细胞大量释放一氧化氮[3]。本文针对TG对心肌梗死后血管新生心室重构以及对心功能的影响作一探讨。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

♂（Sprague-Dawley，SD）大鼠，月龄区间为2～3个月，体重210～240g；选用由北京天然药物研究院所提供的TG，其主要从人参的叶、茎所提取，其中，含人参皂苷Rb15.25%，、Rd13.64%，Re21.59%，Rg15.19%，除此之外，其中还含有其他类型的人参皂类化合物。利用无菌生理盐水配制储存液：2、4gL-1，然后置于4℃环境中保存。选用购自大连宝生物公司的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、VEGF以及逆转录试剂盒；CD31单克隆抗体（Santa Cruz公司）；选用购自美国ABI公司的SYBR GREEN PCR Mas-ter Mix。

1.2 主要仪器

实时荧光定量PCR仪（美国ABI）与2400PCR扩增仪（美国BIO-RAD）；Sequoia 512彩色多普勒超声诊断仪（德国SIEMENS）；Ken2 Cardico302心电图机（北京明成森木医疗公司产）；ALC-V8S小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技公司）。

1.3 心脏彩色超声多普勒检查及筛选

取适量水合氯醛，注射于腹腔，完成麻醉后，将大鼠摆成仰卧位，且加以固定，用硫化钠（1.25mol·L-1）对左胸前进行退毛处理。用彩色多普勒超声诊断仪（探头频率设定为15MHz）对超声心动图进行监测，分别取左室长轴切面与左室乳头肌短轴切面，放大图像，然后以M型取左室后壁，然后用同样型状取左室前壁。选取比较清晰的图像进行录像，并储存，对所得录像进行系统化分析测量：左室短轴缩短率（FS）、左室射血分数（EF）、收缩末期左室容积（LVESV）、舒展末期左室容积（LVEDV）、左心室收缩末期内径（LVDs）、左心室舒张末期内径（LVDd）。

1.4 AMI模型制备与分组

根据相关报道[4]构建AMI模型。气管插管后，与小动物呼吸机相连接，在肺动脉圆锥与左心耳下缘之间，即距离主动脉根部大约为2～3mm位置处，对冠状动脉左前降支实施结扎处理，如果心肌颜色变成暗红色，或者是出现心电图示ST段抬高，则可明确为模型制作成功（Fig1）；假手术组（sham组）共计8只，仅开胸，不进行结扎处理。将建模型成功的大鼠进行分组（3组），TG高剂量组（TG-H组），共计10只，在胸腔处注射TG40mg·kg-1·d-1；TG低剂量组（TG-L组），共计10只，相同部位注射20mg·kg-1·d-1；模型组（model组），共计12只。model组、sham组均实施生理盐水腹腔注射，完成手术后1d，用药，持续用药35d。

1.5 心脏组织病理学检查

将大鼠处死，开胸，并将心脏取出，沿着冠状沟，将心房剪去，于结扎点下方位置，沿着冠状面，把左心室予以横切，使之成为两部分，以肉眼方式对腔径进行观察，同时观察心室壁变化，取心尖组织，采用多聚甲醛加以规定，然后实施脱水、石蜡包埋以及切片HE染色等处理，在显微镜下，对心肌组织的病理学变化进行观察；进行Masson染色，对蓝染的胶原纤维分布情况进行细致观察，然后对心肌纤维化程度进行综合评价。

1.6 Real-timePCR检测基因表达

依据对应的试剂盒说明书，用TRIzol对心肌组织总RNA进行提取，运用专用型紫外分光光度计，对A260与A280比值进行测定，即1.8～2.0区间内。逆转录，稀释处理，加入到cDNA中（7mgL-1），然后再将其加入到SYBR GREEN PCR Mas-ter Mix当中，开展定量PCR检测，反应条件为：72℃，1min，4℃；60℃，20s；95℃，5min；40个循环。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 TG对AMI大鼠心功能的影响分析

相比于sham，model组LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有显著增加（P＜0.05），而FS、EF则有显著减小（P＜0.05），有比较明显的左心室收缩情况，此外，舒张功能存在障碍。采用TG进行持续35d的干预后，相比于model组，TG-H组LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有显著减小（P＜0.05），能够准确反应左心室收缩功能的FS、EF，相比模型组，均有显著增高（P＜0.05）；相比于model组，TG-L组的FS、EF有显著增大（P＜0.05）。见表1。

表1 TG对AMl术后第35d大鼠心功能的影响

2.2 TG对AMI大鼠左心室组织病理学的影响

HE染色之后，在显微镜下进行观察，从中得知，sham组有着比较整齐的心肌纤维排列，不存在破坏情况，且有着均匀、丰富的胞质，有着正常的细胞间隙；而对于model组，其在具体的心肌组织缺血梗死区心室壁方面，则明显变薄，心肌纤维已经消失，且形成瘢痕；TG-H组、TG-L组相比于model组，在心室壁方面有显著增厚，且保存着较多的心肌纤维，能观察到诸多呈岛状的心肌组织，瘢痕面积较小。

2.3 TG对左心室心肌组织bFGFmR-NA、VEGF表达的影响

根据左心室心肌组织real-time PCR最终结果得知，model组相比于sham组，左心室心肌组织bFGF-mRNA、VEGF表达水平比较，差异不明显；相比于model组与sham组，TG-H组与TG-L组能够显著提升bFGF mRNA、VEGF的表达水平（P＜0.05）。

3 讨论

冠状动脉结扎会造成心肌细胞出现不同程度的缺血坏死，由于心肌细胞存在着比较有限的再生能力，且致死区域大部分被纤维组织替代，出现心室重构情况，因而会对心脏功能造成较大程度影响。所以，增加组织血液供应以及血管新生，乃是治疗AMI的核心所在[5]。由本次研究得知，TG持续用药35d后，对大鼠AMI起到了较好的保护作用，另外，在心室重构以及心功能方面，也得到了有效改善；AMI后，大鼠FS、EF得到显著提升，特别是高剂量组，LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有显著减小，表明采用TG治疗后，AMI大鼠心脏舒缩功80FD相比于模型组，有显著提高。经组织病理学测定得知，TG组在具体的心肌梗死面积方面，相比未用药前，得到显著缩小，梗死区心肌纤维化程度比较轻，且存在着诸多心肌细胞，有着比较厚的心室壁，由此得知，TG对于AMI大鼠心室重构，具有显著的抑制作用，这也表明TG对于心功能有较好的抑制作用。

微血管密度能够准确折射出侧支循环的最可靠指标，而梗死范围的大小则能反映出侧支循环的当前情况，且梗死面积与侧支循环之间存在显著负相关，即梗死面积越小，则侧支循环便越丰富[6]。由免疫组染色结果得知，TG组大鼠梗死去的MVD显著增加，由此得知，TG刺激AMI大鼠，使其血管新生，对构建侧支循环有重要促进作用。而由Masson染色与HE染色结果也能得知，在采用TG治疗后，小鼠心肌梗死区域大幅减少，而且胶原纤维也明显减少，有着较多的存活状态的心肌组织。由此表明，TG不仅对AMI后梗死区新生具有促进作用，而且对其周边血管新生，同样具有重要的促进作用，可以增加缺血区血液供应，大幅改善AMI之后的心室重构。bFGF与VEGF实为促进内皮细胞分化与生长的核心要素，在整个血管新生中，其发挥着举足轻重的作用。当出现缺血损伤时，会一定程度上调bFGF、VEGF的表达，造成内皮细胞出现典型的有丝分裂因子活化，此情况对内皮细胞相应增长具有促进作用，还能一定程度诱导血管内皮细胞，使其不断分化与成熟，而对于bFGF来讲，其可以对整合素的表达进行上调，因而能够大幅提升内皮细胞的迁移能力以及黏附能力，最终生成新的血管。有报道已证实，bFGF与VEGF表达上调，可以促使局部组织在灌注与代谢方面的增加，减轻缺血损伤，最终达到改善心功能的目的。由本次研究得知，TG组大鼠梗死区心肌组织bFGF mRNA、VEGF的表达，存在显著增高，特别是高剂量组，更为显著，由此表明，TG能够上调AMI大鼠心肌组织当中的bFGF mRNA与VEGF表达，对缺血区血液供应有改善作用。

VEGF实为一种典型的促血管生成因子，当小鼠心肌缺血发生1d时，在梗死区表达便出现明显升高，诱导出现带有自发性质的血管新生，但是，当梗死持续14d时，其下降至梗死前的水平。由本实验可知，心肌梗死35d时，模型组VEGF水平相比sham组，差异不明显，但TG组VEGF水平却有显著升高。由此可知，TG处理对VEGF有刺激作用，能使其持续高表达，以此对AMI激发的自发性血管新生不足予以补充。

综上所述，TG对改善急性心肌梗死大鼠心室重构及梗死区心肌血液供应以及心脏功能恢复，有显著促进作用，其作用机制与上调心肌组织bFGF、VEGF基因表达相关。