CUL4A、VEGF及N⁃cadherin在胆管癌中的表达和临床意义

夏修良 薛栋 董雪

滨州市人民医院1普外一科，2医院办公室（山东滨州 256610）

胆管癌是指起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，早期诊断率低，易发生淋巴结转移和神经浸润，且对放化疗敏感性较低，胆管癌患者的自然病程约6个月到1年［1］。因此，临床上急切需要探索胆管癌恶性侵袭和转移的分子机制，以找寻高效的预后分子标志物，这对于提升胆管癌的总体临床治疗效果、降低肿瘤致死率具有极其重要的意义。CUL4A（cullin 4A）是新发现的一种CRLs（cullin⁃ringbased E3⁃ligases）泛素连接酶，定位于13q34染色体，CUL4A在多种恶性肿瘤中有高表达，并可作为肿瘤预后的独立因素［2］。沉默卵巢癌细胞中CUL4A基因后，肿瘤细胞的侵袭及迁移能力受到明显抑制［3］。血管内皮生长因子（vascular endotheliar growth factor，VEGF）在调控血管内皮增殖及迁移等过程中起重要作用［4］。上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是促进肿瘤细胞侵袭及转移的中心事件。N-钙黏蛋白（N⁃cadherin）是EMT发生过程中的一个重要分子［5］。目前，关于CUL4A、VEGF和N⁃cadherin在胆管癌组织中的研究文献报道较少。本实验应用实时荧光定量 PCR（quantitativereal⁃time PCR，qRT⁃PCR）技术和免疫组化方法检测胆管癌组织中CUL4A与VEGF、N⁃cadherin的表达，并探讨其在胆管癌侵袭转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2008年1月至2014年1月滨州市人民医院72例胆管癌临床标本，病理证实均为腺癌。男50例，女22例；年龄35～77岁；高分化为31例，中分化为22例，低分化为19例；肿瘤位于肝门部31例，胆总管41例；淋巴结无转移37例，伴有淋巴结转移35例。选取同一个期间36例正常胆管组织（肝内胆管结石行半肝切除或肝部分切除病例）作为对照组。另外，笔者还收集了2011年2月至2013年12月35例新鲜胆管癌和15例正常胆管（肝内胆管结石行左肝外叶切除病例）手术切除标本，立即置于-80℃冰箱或液氮罐中保存。所有病患术前均没有接受放化疗、分子靶向等治疗。依据美国癌症联合委员会（AJCC）制定的临床TNM分期标准（第七版）：符合Ⅰ期为15例，Ⅱ期为25例，Ⅲ期为19例，Ⅳ期为13例。术后随访主要通过门诊复诊、电话、网络及信件等方式进行，中位随访时间48个月。

1.2qRT⁃PCR检测新鲜标本中CUL4A mRNA的表达 Trizol购买于Invitrogen公司。逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购买于Takara公司。按Trizol说明书分别抽提胆管癌组织与正常胆管组织中总RNA。总RNA随即被逆转录成cD⁃NA。CUL4A引物序列为：上游引物5′⁃TACGAGT⁃GGGACTAGATGTA⁃3′，下游引物 5′⁃GGCTCAGAG⁃GTATTGACATC⁃3′；β⁃actin作为内参对照，β⁃actin引物序列为：上游引物5′⁃AGCGAGCATCCTCCAA⁃AGTT⁃3′，下游引物5′⁃GTGCACGAAGGCTCATCA⁃AT⁃3′。PCR 反应体系为 20 μL，反应条件如下：95℃变性1 min；95℃变性10 s；55℃退火15 s，75℃延伸5 min，一共50个循环；然后进行溶解曲线分析。应用2-ΔΔCt法进行定量分析待测基因mRNA的表达。

1.3 试剂和方法 选取我院病理科存档的胆管癌组织蜡块，分别实施CUL4A、VEGF和N⁃cadherin免疫组织化学染色。采用EnVision法检测CUL4A、VEGF和N⁃cadherin蛋白的表达。羊抗CUL4A、兔抗VEGF、兔抗N⁃cadherin多克隆抗体购自Santa Cruz公司，工作浓度均为1∶200。鼠抗羊、鼠抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Envision试剂盒购买于Dako公司，严格遵照试剂盒的使用说明书来操作。同时设立阳性和阴性对照：试剂公司提供的强阳性标本切片视为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗视为阴性对照。

1.4 免疫组化结果判定 CUL4A、VEGF阳性均定位于细胞质，N⁃cadherin阳性定位于细胞膜。在不知任何背景资料的情形下，由两位高年资病理科专业医师采用双盲法进行评定。首先依据染色的强度打分：0分（无阳性染色）；1分（淡黄色）；2分（棕黄色）；3分（棕褐色）。然后将阳性细胞所占的百分比算分：0分（无阳性细胞）；1分（1%～25%）；2分（26%～50%）；3分（51%～75%）；4分（76%～100%）。最后将染色的强度与阳性细胞百分比的乘积统计总分数，记分≥4分视为免疫反应阳性，记分＜4分视为免疫反应阴性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件，非配对t检验用于分析胆管癌和正常胆管中CUL4A mRNA表达的差异。计数资料采用χ2检验，等级相关检验采用Spearman相关检验，生存曲线应用Kaplan⁃Meier法绘制，Log rank方法对组间生存率进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CUL4A mRNA在胆管癌组织中表达上调实时荧光定量PCR分析了35例胆管癌和15例正常胆管组织CUL4A mRNA的表达水平，结果表明CUL4A mRNA在胆管癌组织中表达量是3.876±0.975，明显高于正常胆管组织的表达量1.216±0.265，差异有统计学意义（图1，P＜0.001）。

2.2 CUL4A、VEGF和N⁃cadherin蛋白在胆管癌组织和正常胆管组织中的表达 CUL4A主要表达于细胞质，染色呈棕褐色颗粒（图2）。VEGF主要表达于细胞质，染色呈棕黄色的颗粒（图3）。N⁃cadherin主要表达于细胞膜，呈棕黄色颗粒（图4）。CUL4A蛋白在胆管癌组织及正常胆管组织中的表达率分别为70.8%、2.8%（P＜0.05）。胆管癌组织及正常胆管组织中VEGF蛋白的阳性表达率分别为66.7%、8.3%（P＜0.05）。N⁃cadherin蛋白在胆管癌组织中及正常胆管组织中的表达率分别为58.3%、12.5%（P＜0.05）。见表1。

图1 CUL4A mRNA在胆管癌组织中和正常胆管组织中的表达Fig.1 Expression of CUL4A mRNA in cholangiocarcinoma tissues and normal bile tissues

图2 CUL4A阳性染色（免疫组化染色，EnVision×200）Fig.2 The positive plasma staining of CUL4A（EnVision×200）

图3 VEGF阳性染色（免疫组化染色，EnVision×200）Fig.3 The positive plasma staining of VEGF（EnVision × 200）

2.3 CUL4A、VEGF和N⁃cadherin蛋白表达与胆管癌临床病理特征的关系 CUL4A、VEGF和N⁃cadherin阳性表达均与患者的性别、年龄、CA199水平、肿瘤大小、所在部位无关（均P＞0.05，表2）。CUL4A、VEGF和N⁃cadherin蛋白阳性率随着肿瘤分化差、血管侵犯、神经浸润、淋巴结转移及临床TNM分期升高而增加（均P＜0.05，表2）。CUL4A、VEGF和N⁃cadherin共同促进了胆管癌侵袭转移。

图4 N⁃cadherin阳性染色（免疫组化染色，EnVision×200）Fig.4 The positive membrane staining of N⁃cadherin（EnVision×200）

表1 胆管癌和正常胆管组织中CUL4A、VEGF及N⁃cadherin表达的比较Tab.1 Immunohistochemical results of CUL4A、VEGF and N⁃cadherin in cholangiocarcinoma and normal bile tissues例

2.4 CUL4A、VEGF和N⁃cadherin在胆管癌组织中表达的相关性 Spearman等级检验分析表明，胆管癌组织中CUL4A和VEGF蛋白表达呈正相关（r=0.415，P=0.043），CUL4A和N⁃cadherin的表达也呈正相关（r=0.464，P=0.036）；N⁃cadherin与VEGF的表达也呈正相关（r=0.508，P=0.027）。

2.5 生存分析 对患者分组（根据免疫组化结果）后进行生存分析，CUL4A阳性组患者的生存时间显著短于阴性组患者，3年的生存率分别是44%、67%，患者5年的生存率分别是13%、32%，CUL4A阳性的患者生存时间较阴性患者缩短，差异有显著性（P＜0.05）（图5）。VEGF阳性和阴性的患者3年的生存率、5年的生存率差异均无显著性（P＞0.05）。N⁃cadherin阳性和阴性患者3年生存率、5年生存率差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

泛素化是指泛素在一些催化酶协同下对靶蛋白进行修饰，它不仅参与细胞增殖、凋亡和分化等，还在肿瘤细胞侵袭转移等过程中起关键作用。CUL4A在人类的很多恶性肿瘤中存在高表达，其高表达往往与肿瘤侵袭、临床分期及预后明显相关［6-8］。结直肠癌组织中CUL4A蛋白存在高表达，而且其与肿瘤的大小、分化程度及区域淋巴结转移有关；另外，干扰CUL4A基因后肿瘤细胞的增殖及侵袭力下降［9］。本实验首先采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术检测了CUL4A在胆管癌与胆管组织中的表达，发现胆管癌组织中CUL4A mRNA和蛋白均高表达。笔者还发现CUL4A表达与肿瘤分化程度、血管侵犯、神经浸润、淋巴结转移及临床TNM分期密切有关。CUL4A阳性患者5年生存率较阴性患者明显缩短，提示CUL4A阳性胆管癌患者的预后差。本研究结果表明，CUL4A与胆管癌的发生发展、侵袭转移和临床预后明显相关，其有望成为胆管癌的靶向治疗基因。

表2 CUL4A、VEGF及N⁃cadherin表达与胆管癌临床病理参数的关系Tab.2 Relation between the expression of CUL4A、VEGF and N⁃cadherin protein and the clinicopathological features of cholangiocarcinoma例

图5 72例胆管癌患者CUL4A表达和生存时间的关系Fig.5 Differential expression of CUL4A from 72 cholangiocarcinoma patients and survival rate

肿瘤生长离不开丰富的血液供应，VEGF不仅增加肿瘤组织内微小血管的通透性，还能促进小血管新生［10］。VEGF还与恶性肿瘤的侵袭转移和预后密切相关［11］。本研究结果显示，胆管癌组织中VEGF蛋白存在高表达，还与肿瘤分化、血管侵犯、神经浸润、淋巴结转移及临床TNM分期有关，提示VEGF在胆管癌恶性侵袭转移中起重要作用。胆管癌中CUL4A与VEGF的表达存在正相关，推测CUL4A可能通过调节VEGF表达促进胆管癌组织中血管新生。

上皮-间质转化（EMT）是肿瘤获得侵袭和迁移的重要分子机制。当N⁃cadherin表达明显增加致细胞之间的黏附力降低，导致肿瘤细胞局部侵袭和远处转移［12］。EMT是胆管癌细胞侵袭转移的一个关键步骤［13］。敲除前列腺肿瘤细胞N⁃cadherin基因后，癌细胞的侵袭、转移力显著下降［14］。本研究结果显示，胆管癌组织中N⁃cadherin存在高表达，其高表达伴随肿瘤分化差、神经浸润、淋巴结转移及临床分期较晚。

综上所述，CUL4A基因在胆管癌中的临床应用价值得期待，即CUL4A有可能成为胆管癌分子标记物和治疗靶点，鉴于此，下一步需要开展更深入分子机制研究。