结直肠癌根治术后骨转移的危险因素及潜在预测指标初探

李伟学 田宋君 詹争明 林先盛

1武汉科技大学附属汉阳医院普外科（武汉430050）；2安徽省立医院普外科（合肥 230001）

目前研究发现，术前对肿瘤的T分期、淋巴转移情况及Duckes分期影响结直肠癌预后的独立影响因素，除此之外手术中的麻醉方式、围术期输血及治疗方式也是相关影响因素［1-3］。但是上述因素多基于肝转移、肺转移展开，却鲜见结直肠癌骨转移的影响因素分析。同样也缺少可靠的，可以预测结直肠癌骨转移的潜在指标。TSAI等［4］研究发现结直肠癌患者术前血清中癌胚抗原（CEA）与糖类抗原199（CA199）水平可作为评估结直肠癌临床病理关系的指标之一，亦有学者提出多种病理学指标与结直肠癌病情转归息息相关［5］，但未见关于骨转移不良预后的报道。因此，本研究通过对本院的结直肠癌患者进行跟踪随访，探索其接受结直肠癌根治术后发生骨转移的主要影响因素，并探索其潜在的预测骨转移指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2007年1月-2011年1月我院确诊并收治的结直肠癌患者作为研究对象，共513例，其中女141例，男372例，平均年龄（63.59±12.45）岁。纳入标准：（1）术前未进行化疗或生物治疗等干预；（2）进行根治性切除手术；（3）术后病理证实为腺癌或黏液腺癌。排除标准：（1）合并感染及其他系统疾病等对炎性反应指标有影响的疾病；（2）出现消化系统出血、梗阻以及穿孔等急诊手术患者；（3）术前检查发现已合并或转移多处肿瘤；（4）术后局部复发或3个月内出现远处转移；（5）结直肠癌术后复发二次手术者。所有患者及家属均签署知情同意书，该研究获伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床资料记录 患者入院后以问询的方式整理并收集完整临床资料，包括性别、年龄、身高、体重、病程、病史，结合影像学检查及其他检查记录合并症、肿瘤位置、肿瘤大小、病理学类型、浸润深度、淋巴结转移情况。

1.2.2 术前相关指标检测 治疗前及手术后第2周，采用罗氏ELECSYS 2010全自动电化学发光免疫分析系统，患者晨起空腹状态下抽取静脉血液3 mL，依次进行抗凝、离心，取血浆置Eppendorf管中，在-80℃的冰箱中冷冻保存待检。CA242含量测定：CA242双抗体直接夹心诊断试剂盒（北京博奥龙免疫技术有限公司）测定血清CA242含量；CEA含量测定：ELISA法直接检测血清CEA浓度；CA199含量测定：配套CA199试剂，对患者进行空腹采血2 mL，按照标准操作检测CA199含量。

1.2.3 手术治疗 患者入院后予以二级护理，低盐低脂饮食，术前进行灌肠、控制血压血糖、备血等术前准备，患者均进行根治性D3术式。（1）患者接受开腹式结直肠癌根治术，严格遵循肿瘤根治原则进行手术操作，保持直肠系膜的环切缘完整切除，保证两端足够切缘。直肠癌及乙状结肠下段癌数千钧常规进行直肠腔内5-氟尿嘧啶化疗。术中遵守无瘤操作及肿瘤整块切除原则，在关闭腹腔前对肿瘤侵及肠壁浆膜者用温热蒸溜水反复冲洗腹腔并将5-氟尿嘧啶置入腹腔中。（2）患者接受腹腔镜结直肠癌根治术，严格遵循肿瘤根治原则进行手术操作，建立气腹，气腹压保持12～14 mmHg，在分离肠段、结扎血管、清扫淋巴结后，将肿瘤切除并装入自制尼龙袋从腹壁切口取出，尽量避免肿瘤组织与切口直接接触，最后进行吻合肠段。术后给予一级护理，密切观察电解质平衡和炎症发生，早期制定规范的辅助放、化疗方案。如有其他不适进行对症处理，手术过程见图1。

图1 结直肠癌手术图片Fig.1 Images of surgery for colorectal cancer

1.2.4 术后相关指标检测 鼠抗人表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体（MAB-0196）、鼠抗人人类表皮生长因子受体2（HER2）单克隆抗体（MAB-0198），均购于杭州瑞晶有限公司。对二甲氨基偶氮苯（DAB）购于上海源叶生物科技有限公司。仪器均由我院提供，包括：石蜡切片机、奥林巴斯CX23显微镜及电热恒温干燥箱（56～65℃）。

手术中切除标本经固定（10%福尔马林）、包埋（石蜡）、切片至4 μm厚度后，采用免疫组化法进行检测。二甲苯与梯度乙醇（100%、95%、85%）处理切片各3 min进行常规脱蜡脱水，PBS试剂反复冲洗，加入3%过氧化氢-甲醇溶液静置10 min。每张切片加入50 μL非特异性血清静置10 min以消除非特异性染色，加入一抗，37℃下孵育2 h，PBS洗净，滴加二抗孵育0.5 h。DAB显色3～10 min，水洗、苏木精复染、脱水、封固。请我院病理科2位专家于显微镜下观察结果，全程双盲。HER2的阳性着色区位于胞膜，胞膜棕黄色颗粒样视为HER2阳性结果；EGFR的阳性着色区位于胞膜、胞质，胞膜及胞质出现黄棕色染色视为EGFR阳性结果。见图2。

结果判定：（-）切片无阳性显色细胞；（+）浅黄色，阳性细胞在切片中的分布范围5%～25%；（++）棕黄色，阳性细胞分布范围26%～50%；（+++）深棕黄色，阳性细胞分布范围＞50%。

1.2.5 术后随访 对所有参与研究的患者进行为期5年的随访，首次随访为治疗结束后3个月后，之后每隔6个月电话随访一次。终点事件定义为：患者随访期间发现骨转移或出现其他器官转移。确诊出现骨转移时，对患者进行腹部或盆腔增强CT复查，对于疑似患者采用骨发射型计算机断层扫描进行骨转移确诊，或进行病理证实发生骨转移。患者拒绝访问、中途退出、死于与骨转移无关原因的定义为失访。根据随访结果，将出现骨转移的患者定义为骨转移组，其余患者定义为对照组。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用平均数±标准差来表示，对于性别等计数资料用例数表示。根据随访结果，计算不良预后率并绘制生存曲线。对于可能影响结直肠癌术后骨转移的因素，采用单因素、多因素Cox回归进行分析。筛选后建立ROC曲线评价潜在指标对结直肠癌根治术后骨转移的预测能力。

2 结果

2.1 患者一般资料分析 本次研究共收录结直肠癌患者513例，年龄27～83岁，平均（63.59± 12.45）岁，平均肿瘤大小为（5.49±0.66）cm；平均淋巴结转移为9.45个；平均术前CEA水平为（21±17.47）μg/L，平均术后CEA水平为（17.35±23.62）μg/L；平均术前CA199水平为（75±21.24）kU/L，平均术后CA199水平为（83.30±12.74）kU/L；平均术前CA242水平为（41.32±36.85）U/mL，术后为（33.94±32.16）U/mL。513例病患中，276例组织切片EGFR呈阳性，其中，等级为（+）的患者有55例，等级为（++）的患者有103例，等级为（+++）的患者有118例，其平均阳性表达率为（40.21±8.45）%。341例的组织切片呈现HER2阳性表达结果，122例为（+），82例为（++），余下137例为（+++），平均阳性表达率为（57.83±11.62）%。

2.2 随访结果 在随访结束时，全体患者失访27例，210例到随访结束未发生终点事件，276例出现了终点事件，其中24例为骨转移。Kaplan⁃Meier生存曲线（图3），经计算，患者的骨转移发生率为4.94%。

图2 免疫组化染色图片Fig.2 Immunohistochemical staining

2.3 影响结直肠癌根治术后骨转移预后情况的单因素分析 单因素分析结果显示：肿瘤位置、肿瘤类型、浸润深度、淋巴转移、术前CEA水平、术后CEA水平、术前CA199水平、术前CA242水平、TNM分期、EGFR阳性表达（+++）、HER2阳性表达（++）及（+++）、细胞分化程度及是否伴随肺转移对患者骨转移有影响，差异有统计学意义（P＜0.05）。而患者性别、年龄、平均肿瘤大小、手术类型、术后CA199、术后CA242及细胞增殖程度对患者术后骨转移并无明显影响（P＞0.05）。

图3 结直肠癌根治术手预后不良率的生存曲线Fig.3 Survival curves of poor prognosis rate in colorectal cancer

2.4 影响结直肠癌根治术后骨转移预后情况的多因素Cox比例回归分析 多因素Cox回归结果显示：细胞分化程度（P=0.018）、浸润深度（P=0.038）、EGFR阳性表达（+++）（P=0.013）、HER2阳性表达（+++）（P=0.026）、术后CEA水平（P=0.002）、术前CA199水平（P=0.001）及术前CA242水平（P=0.031）对患者骨转移有影响；肿瘤位置、类型，是否肺转移，TNM分期，术前CEA，淋巴结转移对患者骨转移的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.5 ROC曲线评价三种检查方法诊断结直肠癌骨转移效能 运用ROC曲线结果显示：术后CEA水平、术前CA199水平、术前CA242水平的AUC分别为0.814、0.774、0.801；选取术前 CA242与术后CEA做联合诊断，其AUC为0.885，其预测的敏感性和特异性分别为88.5%、84.8%。

3 讨论

结直肠癌浸润可通过淋巴管、血管和神经这三种途径，其中血管浸润更容易发生远处转移，通过门静脉和下腔静脉进行较早的远处转移，包括骨转移［6-7］。在治疗早期，应密切关注结直肠癌浸润程度，对转移淋巴结进行仔细排查，对于浸润程度高或已发生淋巴结转移的应提前准备放化疗方案，在根治术后进行常规治疗。除此之外，病理学指标EGFR、HER2是肿瘤检测及预后影响因素中研究较新关注点较高的一类指标，我国学者宋均飞等［8］在其研究中证实EGFR、HER2在结直肠癌

患者中异常高表达，有望作为新的肿瘤标志物。EGFR与HER2均是受体酪氨酸激酶受体家族成员之一，EGFR高度亲和表皮生长因子，一旦表达过量，可迅速激活本身的酪氨酸激酶，为肿瘤细胞增殖分化提供信号，同时促进新生血管生成［9-10］。HER2的结构和功能与EGFR较为相似，二者联合表达对肿瘤细胞发生侵袭、转移呈现协同作用［11-12］。在本文研究中，单多因素COX回归结果显示EG⁃FR及HER2的高度阳性表达是结直肠癌肿瘤发生骨转移的影响因素，提示EGFR及HER2的早期筛查确有一定价值，可作为协同预测指标。

表1 结直肠癌根治术后骨转移预后影响因素的单因素分析Tab.1 Single factor analysis of factors influencing prognosis of bone metastases after colorectal cancer surgery

表2 结直肠癌根治术后骨转移预后影响因素的多因素分析Tab.2 Multifactor analysis of factors influencing prognosis of bone metastases after colorectal cancer surgery

图4 术后CEA水平、术前CA199水平及术前CA242水平诊断骨转移的ROC曲线分析Fig.4 ROC curve analysis of bone metastases by postoperative CEA，preoperative CA199，and preoperative CA242

在结直肠癌中，CEA水平作为糖类抗原对癌症发生有较高的敏度度和特异度，在不同的病例程度下，术前术后CEA水平在血清中表达也随之不同［13-15］。在本研究中，除了术后CEA水平，术前CA199水平及术前CA242也是术后骨转移的影响因素。CA199水平越高，预后越差。虽然肿瘤标志物水平并不能作为确诊或诊断结直肠癌，或直接判断发生骨转移，但可联合多指标预测术后转归情况，提高预测敏感性。

对以上危险因素进行多因素Cox比例回归分析发现，术前CA199水平与术前CEA水平对结直肠癌术后骨转移影响最大。根据以上相关危险因素，本研究发现，联合术后CEA水平和术前CA242水平评估患者骨转移，其敏感性相比二者单独预测时均有提高，联合检测敏感性可高达88.95%，且血清检查较为方便。因此，结直肠癌根治术后患者应按时进行血清检查，建议患者术后2周进行CEA水平及CA242水平血清检查进行术后复查，术后3年应3～6个月进行一次CEA水平及CA242水平血清检查，及时检查肿瘤标记物以进行预后干预。

然而，本研究结果仅有肿瘤标志物指标，病理学指标主要以分类变量表示，在一定程度上影响了结果的准确性；本研究虽然得出了相关危险因素，但未能解释危险因素影响病程进展的根本原因，只能对预后进行预防。

综上所述，本研究表明术后CEA水平、术前CA242、术前CA199水平、浸润深度、细胞分化程度、EGFR（+++）和HER2（++）、（+++）是结直肠癌根治术后骨转移的独立危险因素，术后CEA水平和术前CA242水平二者联合检测可对骨转移预后进行预测，以此提高患者预后情况。