埃及研究奶牛隐性乳房炎预警新指标MAA

文│伍佰鑫 何芳 浣成 段洪峰（湖南省畜牧兽医研究所）

朱彦群 张永红（湖南金健乳业有限责任公司）

乳房炎是由几种细菌及其毒素引起的乳腺炎症，是奶牛最常见的疾病之一。患畜产奶量减少、牛奶质量改变，未到使用年限就不得不被淘汰，给奶牛养殖者造成了重大的经济损失。隐性乳房炎会负面影响到牛奶质量（牛奶中含有炎症要素和细菌）；减少的奶量会占到总损失奶量的2/3；患畜会成为其他奶牛感染隐性乳房炎的传染源。目前，主要通过体细胞数（SCC）分析的方式筛查乳房内感染，健康奶牛乳中SCC较少；如果SCC（大量）增加，就暗示有隐性乳房炎。但是，SCC受很多因素影响，如年龄、泌乳天数、季节、应激、饲养管理和日复一日的变化。因此，SCC并不总是与乳房感染有关。

病原微生物进入乳池就开始增殖，诱导先天性免疫系统抵抗入侵者，伴随牛奶中的SCC和乳头管上皮细胞数增加，接着是细胞因子（小分子多肽）的合成上调。这些细胞因子诱导血管内皮黏附分子表达，促进中性粒细胞（体细胞）跨内皮细胞向感染部位迁移。其中一些细胞因子诱导急性期反应，表现为发烧、白细胞动员、促进急性期蛋白质（APP）的产生。

反刍动物主要的APPs是血清淀粉样蛋白A（SAA）和结合珠蛋白（Hp）。机体组织损伤后（24小时），血浆和（或）其他体液中的SAA浓度迅速而强烈地增加（1000倍），使得这种蛋白作为非特异性的炎症标记物具有潜在的应用价值。牛奶中的这种蛋白水平是奶牛乳房炎感染的敏感指标。

埃及的哈尼·艾哈迈德·侯赛因（Hany Ahmed Hussein）等学者，通过对68头（每头4个乳区）处于泌乳中期的奶牛采集272份奶样、检测奶样中的SCC和MAA（乳淀粉样蛋白A）浓度、分离培养出344个细菌菌株，发现了引起乳房炎的主要病原体，即链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。同时，比较了SCC与MAA检测结果的相关性。

一、研究方法

对68头（每头4个乳区）处于泌乳中期的黑白花奶牛，采集272份奶样，每份奶样15毫升。采样前，用浓度为70%的酒精消毒乳头，前3次挤出的奶不采集。采样后，将样本装入消毒管，置于冰块上，转移至实验室，24小时内进行SCC和细菌检测。奶样在-18℃条件下保存，直至MAA分析结束。272份奶样中，220份（80.88%）来自临床诊断为健康的奶牛；52份（19.12%）来自临床诊断为有乳房炎症状的奶牛：挤奶有痛感、乳房肿胀、产奶量减少、牛奶质量明显改变（微黄色、有块状物）。

运用基于荧光图像分析技术的NucleoCounter体细胞检测仪检测奶样中的SCC，测定范围为1万～200万个细胞/毫升。所有奶样都取10微升样品，37℃培养于血琼脂基质、麦康基琼脂、马-欣二氏琼脂（波兰）和爱德华兹培养基（英国），分别培养24小时和48小时。通过革兰氏染色记录菌落形态，运用API检验（波兰）对分离的细菌进行详细鉴定。

根据SCC和细菌检测，将奶样分为7个组：G1-菌检（-）、SCC≤50万个细胞/毫升；G2-菌检（-）、SCC＞50万个细胞/毫升；G3-菌检（+）、SCC≤20万个细胞/毫升；G4-菌检（+）、20万个细胞/毫升＜SCC＜50万个细胞/毫升；G5-菌检（+）、50万个细胞/毫升＜SCC≤100万个细胞/毫升；G6-菌检（+）、100万个细胞/毫升＜SCC≤200万个细胞/毫升；G7-菌检（+）、SCC＞200万个细胞/毫升。运用酶联免疫吸附测定套件（ELISA，爱尔兰）并根据说明书，测定上述5个阳性组奶样的MAA浓度。主要测定过程是将牛奶和生物素化单克隆SAA抗体培养在微滴板孔内，牛奶中的MAA被黏结成像三明治的标记物；冲洗移除未黏结物之后，在酶底物（四甲基联苯胺）加入之前，将剩余物和链霉亲和素-过氧化物酶一起培养在微滴板孔内；加入酶底物之后停止反应。运用自动平板阅读器（美国），在450纳米处测定微滴板孔内的光密度；通过绘制MAA浓度与光密度的关系曲线，确定样品中未知的MAA浓度。样品先按1∶50稀释，然后一式两份载入。

二、研究结果

272份奶样中，68份（25%）菌检为阴性、204份（75%）菌检为阳性。204份中，96份只受单一病原体感染，占总奶样数（272份）的35.3%；108份受多种病原体感染，占总奶样数（272份）的39.7%。从272份奶样中分离出344个细菌菌株，其中，链球菌132个（占总奶样数的48.53%）、大肠杆菌100个（占总奶样数的36.76%）、金黄色葡萄球菌80个（占总奶样数的29.41%）、凝固酶阴性葡萄球菌32个（占总奶样数的11.76%）。

有乳房炎临床症状奶牛的52份奶样中，40份（76.92%）菌检为阳性、12份（23.08%）菌检为阴性。没有乳房炎临床症状奶牛的220份奶样中，148份（67.27%）的SCC≤50万个细胞/毫升，但其中100份菌检为阳性，可能是感染初期，中性粒细胞还没有完全在感染部位云集；其余的72份（占32.73%）SCC＞50万个细胞/毫升，但其中8份菌检为阴性，可能有其他病原体（霉菌或支原体）感染而没有被检测出来。

7个组奶样（G1～G7）的MAA浓度分别是3.58毫克/升、35.20毫克/升、13.01毫克/升、28.07毫克/升、31.23毫克/升、39.35毫克/升、37.22毫克/升，MAA与SCC有很强的相关性。特别是G3组（SCC≤20万个细胞/毫升、菌检为阳性）的MAA约是G1组（SCC≤50万个细胞/毫升、菌检为阴性）MAA的4倍，表明受细菌感染后，MAA有显著变化。相对于隐性乳房炎的其他诊断指标来说，MAA的优势是：健康动物乳中MAA的含量极少，无法被检测到；除乳房炎外，MAA不受其他因素影响，能在保存的样品中被检测到。因此，牛奶中的MAA浓度是比检测SCC更有用的诊断指标，可监控奶牛的乳房健康。

三、启迪和讨论

有乳房炎临床症状奶牛的52份奶样中，40份（76.92%）菌检为阳性、12份（23.08%）菌检为阴性；说明临床诊断有乳房炎的多数（76.92%）确实有乳房炎，少数（23.08%）实际上没有乳房炎，也就是说，根据表面现象诊断并不是100%准确。这52份奶样占总奶样数（272份）的19.12%，再根据总奶样数中有204份（75%）菌检为阳性，可判断出临床诊断不出的隐性乳房炎占55.88%（=75%-19.12%）；也就是说，半数以上的乳区看起来健康，实际上是亚健康。

没有乳房炎临床症状奶牛的220份奶样中，148份（67.27%）的SCC≤50万个细胞/毫升，据此判断无隐性乳房炎；实际上只有54.55%{=（220-100）÷220}的奶样菌检为阴性（的确无隐性乳房炎），说明单纯依靠SCC判断无隐性乳房炎的误差是12.72%（=67.27%-54.55%）。其余72份（32.73%）的SCC＞50万个细胞/毫升，据此判断有隐性乳房炎；实际上只有29.09%{=（72-8）÷220}的奶样有隐性乳房炎，说明单纯依靠SCC判断有隐性乳房炎的误差是3.64%（=32.73%-29.09%）。由此看来，根据SCC＞50万个细胞/毫升判断有隐性乳房炎的准确度（误差小），高于根据SCC≤50万个细胞/毫升判断无隐性乳房炎的准确度（误差大）。

用MAA检测隐性乳房炎奶样很可能更加准确，但检测过程复杂，亮点是展示了在奶样上做文章的创新思维。目前，国内主要根据SCC预警隐性乳房炎奶样（奶牛），多数运用丹麦福斯集团公司FossomaticTM FC体细胞仪，检测过程方便快捷。但一般情况下，如果没有额外进行菌检和细菌培养，则不能肯定地说SCC为多少时就一定（没）有隐性乳房炎。

总而言之，在生鲜牛奶的生产上，需要快速而准确地识别出有隐性乳房炎的奶牛并及早防治，减少经济损失，保证牛奶质量。因此，国内仪器设备生产厂家应结合MAA、SCC和菌检研制出“中国制造”的隐性乳房炎检测仪器，在21世纪人工智能时代，助力中国科技走在世界前列。