地黄饮子汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

脑缺血再灌注是指脑组织缺血损伤后，再灌注恢复血流加重损伤，是临床常见缺血性脑血管病，由于预后较差，因此越来越引起医学界重视。地黄饮子汤首见于黄帝内经中《素问·玄冥论方》，治疗缺血性脑血管病，具有驱毒化瘀、滋肾阴、补肾阳功效[1- 2]，中医辨证论治具有起效快、效果好等特点，地黄饮子汤已应用于临床治疗缺血性中风、血管性痴呆、阿尔茨海默病等，具有促进神经功能恢复、保护神经元作用[3- 4]。本实验通过不同剂量地黄饮子汤治疗脑缺血再灌注大鼠，观察大鼠学习记忆能力和行为学改变，为地黄饮子汤保护脑神经提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 辽宁中医药大学医学院动物实验部喂养的Wistar大鼠80只，雌雄不限，体重为250 g～280 g，动物合格证号：SCXK- LN2015- 0012。

1.2 造模及分组

1.2.1 造模[5]适应性喂养1周后造模，除对照组外，其余3组用10%水合氯醛腹腔麻醉、固定，颈部正中切开，分别分离两侧颈总动脉并钳夹30 min(纱布覆盖切口创面)，再灌注(松开动脉夹)30 min，再次钳夹30 min，再灌注30 min，造模结束。

1.2.2 分组 在造模后随机分为地黄饮子汤高剂量组(HD组)、地黄饮子汤低剂量组(LD组)、模型组(CI组)、对照组(CC组)，各20只。HD组：地黄饮子汤每日灌服36g/kg；LD组：地黄饮子汤每日灌服6.25 g/kg；CI组：每日灌服盐水1次；CC组：正常饮食。所有大鼠连续喂药4周。

1.3 地黄饮子汤 源于刘河间《素问·玄冥论方》，组方：熟地黄12 g，巴戟天15 g，白茯苓12 g，山茱萸15 g，石斛15 g，石菖蒲6 g，炮附子15 g，麦冬6 g，肉苁蓉15 g，五味子10 g，肉桂6 g，生姜3 g，大枣3 g，共133 g。浸泡2 h后，加10倍水量煎煮40 min，过滤，再次加8倍水量煎煮40 min，过滤。合并两次过滤液浓缩后，密封放入冰箱备用。

1.4 仪器 辽宁中医药大学医学院动物实验部提供Morris水迷宫实验记录仪进行检测，OLYMPUS光学显微镜观察，YLS- 3T跳台仪。

1.5 观察指标

1.5.1 Morris水迷宫实验 给药4周后测试大鼠学习能力和记忆能力。进行定位航行试验5 d，分别记录每只大鼠在游泳池中游行到达平台的潜伏期，在游行中错过平台的次数。跳台实验：用于重复测量训练后大鼠的长时空间记忆能力，即大鼠刺激后回避反应的时间(潜伏期)。第1天，将大鼠放在平台上适应环境5 min，开始通电，观察大鼠双足同时跳上绝缘台，训练3 min；第2天开始电脑测试每只大鼠在3 min内跳上绝缘台的次数，并计算跳台时间(潜伏期)，连续训练4 d。记忆力好的大鼠在3 min内跳台次数多，时间短。

1.5.2 行为学实验 进行Morris水迷宫和跳台实验后每只大鼠进行Longa评分和Berderson评分。Longa评分将大鼠行走姿态分为5级。1级：行为正常计0分；2级：一只前爪不能完全伸展开计1分；3级：朝向一侧转圈行走计2分；4级：朝向一侧倾斜行走计3分；5级：不能行走计4分。行Berderson评分时提起大鼠尾巴悬空观察前肢状态，分4级：正常前肢不完全伸展计0分；轻度一侧前肢长时间屈曲计1分；中度放下大鼠，拽它尾巴滑动无抵抗，无自主转圈计2分；重度无抵抗伴自主转圈计3分。

1.5.3 脑梗死面积 Morris水迷宫、跳台实验和行为学评分结束后，取脑组织冷冻10 min后做冠状脑切片，加入2，3，5- 三苯基四氮唑磷酸液(TTC)染色，避光30 min，加入多聚甲醛冷藏24 h，在电镜下图像分析脑组织梗死面积，脑梗死=(白色梗死面积/总面积)×100%。

2 结 果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较 CC组、HD组和LD组学习记忆能力错误次数和潜伏期均明显低于CI组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较(±s)

2.2 各组大鼠跳台实验结果比较 CC组、HD组和LD组跳台实验的潜伏期均明显低于CI组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠跳台实验结果比较(±s) s

2.3 各组大鼠行为学实验结果比较 HD组和LD组Longa评分和Berderson评分均明显低于CI组，且HD组Longa评分和Berderson评分均明显低于LD组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠行为学实验结果比较(±s) 分

2.4 各组大鼠脑梗死面积比较 HD组和LD组脑梗死面积均明显低于CI组，且HD组脑梗死面积明显低于LD组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠脑梗死面积比较 %

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤是一个多机制、多因素的级联过程，包括过氧化反应、细胞凋亡、氨基酸过度兴奋产生毒性、钙离子超载等，造成神经细胞数量减少，神经功能部分缺失，较少的神经可被修复，因此在脑缺血急性期和恢复期治疗至关重要[6- 7]。

地黄饮子汤中，熟地黄与山茱萸相配，补肾阴、填肾精，共为君药；石斛、五味子、麦冬滋阴收敛固精，同为补阴药；巴戟天与肉苁蓉温补肾阳；炮附子与肉桂温养下元，引火归原；石斛与麦冬配伍，共为臣药，同为补阴药。补阴药与补阳药相伍，阴阳同补，滋肾阴、补肾阳，标本同治[8- 9]。有研究表明，地黄饮子汤具有镇静、益智、抗痴呆、抗惊厥等功效，能改善脑部血液循环，诱导骨髓干细胞转化为神经细胞，促进内源性神经再生、脑血管新生等，使新生神经细胞迁移至缺血区，弥补缺失神经功能[10- 11]。

学习记忆是大脑的功能，通过检测大鼠行为学改变，辨别大脑功能损伤程度。空间探索是辨别记忆能力的经典方法之一。本研究中大鼠急性脑缺血再灌注损伤造模后，分别给予不同药物干预，结果显示：地黄饮子汤干预后大鼠学习记忆能力明显提高，行为学Longa评分和Berderson评分明显降低，脑梗死面积明显减少。高剂量地黄饮子汤组较低剂量组在行为学评分和脑梗死面积的改善效果更好，实验结果表明高剂量地黄饮子汤组疗效优于低剂量组，该结果与周妍妍等[12]研究结果一致。地黄饮子汤能改善脑部微循环，促进神经元细胞代谢和再生，抑制脑细胞发生过氧化反应，有效清除过多的氧自由基，减少氧自由基造成的损伤，保护神经细胞功能，同时地黄饮子汤能减少神经元凋亡，修复受损的神经细胞，促进神经细胞再生等功能，提高学习记忆能力[13- 14]。

综上所述，地黄饮子汤能修复神经损伤，高剂量地黄饮子汤能更好地提高学习记忆能力和行为能力，减少脑梗死面积，改善大鼠脑缺血再灌注对脑组织的损伤，为治疗中风后神经功能的恢复提供理论依据。