UFDS系统检测蛋白质SUMO化修饰研究

龚 宇, 李迎秋

1.广州医科大学附属第三医院, 广州 510150；2.中山大学生命科学学院, 广州 510275

SUMO化修饰是一种多功能的蛋白质翻译后修饰方式，随着其参与的众多功能被陆续阐明，相关研究越来越受到人们关注。然而由于SUMO化修饰的瞬时性，大多数蛋白质在体内的SUMO化修饰很难被检测，导致SUMO化修饰位点的准确鉴定面临很多困难，因此建立应用于细胞内(外)筛选SUMO化修饰靶蛋白的技术方法至关重要。

SUMO化修饰与泛素化修饰相似，也是一个可逆的级联酶促反应过程。循环包括成熟、活化、结合、连接和解离等步骤；SUMO前体分子经泛素相似蛋白加工酶或 SUMO 特异性蛋白酶切除C端短肽后成熟；成熟的SUMO由SUMO活化酶(Uba2/Aosl异源二聚体)通过ATP依赖的SUMO-腺苷酸中间体介导，与Uba2的半胱氨酸残基通过硫酯键相连而活化；随后，活化的SUMO通过转酯反应转移至SUMO特异性结合酶即Ubc9的半胱氨酸残基上，Ubc9将SUMO分子结合到靶蛋白完成SUMO化；SUMO连接酶识别底物，促进某些靶蛋白的SUMO化；靶蛋白的去SUMO化是由SENP家族介导的，去SUMO化后SUMO分子重新进入循环[1,2]。依据SUMO化修饰反应过程的特点，Rainer Niedenthal研究团队提出了一种分析靶蛋白SUMO化修饰的新方法：UFDS系统(Ubc9 fusion-directed SUMOylation system)，即Ubc9融合介导的SUMO化修饰系统，通过融合表达SUMO结合酶Ubc9和靶蛋白来放大SUMO与靶蛋白的结合，从而使SUMO化修饰的靶蛋白量显著增加，最终大大提高检测靶蛋白SUMO化修饰的效率[3～5]。

本研究将应用UFDS系统来检测PKCθ的SUMO化修饰。我们构建了带FLAG标签的Ubc9-PKCθ的真核表达载体，获得了Ubc9和PKCθ的融合表达产物，再利用免疫共沉淀和Western印迹检测证明了Ubc9-PKCθ可以发生SUMO化修饰，进一步通过点突变技术发掘了PKCθ上可能发生SUMO化修饰的关键位点，从而验证了UFDS系统是筛选SUMO化修饰靶蛋白的有效方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胚肾293T细胞由本实验室传代培养；pFLAG-CMV-2、pEF6/cMyc真核细胞表达载体为本实验室保存；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；PfuUltraⅡFusion HS DNA polymerse、QuikChange 定点突变试剂盒均购自Stratagene 公司；各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司；DNA连接酶购自New England公司；用于免疫共沉淀的PKCθ (610090)抗体购自BD公司；用于Western印迹的cMyc (9E10)(sc-40)、 PKC θ (C-19)(sc-1875)抗体均购自Santa Cruz公司，FLAG M2(F3165)抗体购自Sigma-Aldrich公司。引物序列见表1。

表1 本研究所用PCR引物序列Table 1 Primer secquence in this study.

1.2 实验方法

1.2.1UFDS系统构建 根据Rainer Niedenthal的方法构建UFDS系统，即构建Ubc9和PKCθ融合表达的载体，将PKCθ表达在Ubc9的C端：先将通过PCR扩增的Ubc9的CDS连接到载体pFLAG-CMV2上，再将通过PCR扩增的PKCθ的CDS连接到载体FLAG-Ubc9的下游，接着在293T细胞中表达带FLAG标签的Ubc9-PKCθ。

①构建FLAG-Ubc9真核表达载体：以Jurkat E6.1细胞总cDNA为模板扩增人Ubc9 CDS的全长序列，PCR反应体系为：PfuULtra II Fusion HS DNA Polymerase 1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L)1 μL，上、下游Ubc9引物(100 ng/μL)各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 补足到50 μL(引物序列见表1)。PCR反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，40次循环；72℃ 3 min，4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带；Ubc9的PCR纯化产物经HindⅢ和BglⅡ酶切消化后，与事先制备好的同样具有HindⅢ和BglⅡ粘性末端的pFLAG-M2质粒载体连接，得到FLAG-Ubc9质粒。

②构建FLAG-Ubc9-PKCθ真核表达载体：以Jurkat E6.1细胞总cDNA为模板扩增人PKCθ CDS的全长序列，PCR反应体系为：PfuULtra II Fusion HS DNA Polymerase 1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L)1 μL，上、下游PKCθ引物(100 ng/μL，引物序列见表1)各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 补足到50 μL。PCR反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 35 s，40次循环；72℃ 3 min，4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带；PKCθ的PCR纯化产物经KpnⅠ和BamHⅠ酶切消化后，与事先制备好的同样具有KpnⅠ和BamHⅠ粘性末端的FLAG-Ubc9质粒载体连接，最终得到FLAG-Ubc9-PKCθ质粒。

1.2.2基因点突变重组质粒构建 参考Stratagene公司QuikChange定点突变试剂盒操作说明。以野生型FLAG-Ubc9-PKCθ质粒为模板，根据实验目的设计PKCθ-K227R、PKCθ-K261R、PKCθ-K325R、PKCθ-K376R、PKCθ-K412R、PKCθ-K506R和PKCθ-K656R引物(引物序列见表1)，在PfuUltraⅡFusion HS DNA polymerse的作用下进行PCR反应，PCR反应体系为：PfuULtra II Fusion HS DNA Polymerase 1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L) 1 μL，上、下游引物(125 ng/μL) 各1 μL，DNA模板(20 ng/μL)2.5 μL，ddH2O 补足到50 μL。PCR反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 30 s，55℃ 1 min，68℃ 1.5 min，20次循环；68℃ 10 min，4℃。为了增加阳性克隆的检出率，将扩增结束后的PCR产物用限制性内切酶DpnⅠ消化，从而使原始模板DNA被消化，选择性地保留突变DNA；DpnⅠ消化产物转化大肠杆菌后通过氨苄抗性筛选阳性克隆；突变体最终由DNA测序加以验证。

1.2.3质粒瞬时转染哺乳动物细胞 转染前24 h用含10%胎牛血清的无抗DMEM培养基将人胚肾293T细胞接种于6孔板中，接种量以转染时70%～80%的细胞密度为宜。用50 μL opti-MEMI稀释1 μL Lipofectamine 2000脂质体，室温静置5 min；期间用50 μL opti-MEMI稀释1 μg质粒，然后将上述两种溶液混匀，室温静置20 min后加入6孔板中；37℃ 5% CO2常规培养4～6 h后换新鲜DMEM培养基，24～48 h后回收细胞。

1.2.4免疫共沉淀和Western印迹检测 转染48 h后收集细胞，裂解上清分为两部分，一部分为全细胞裂解液，作为内参，用于检测转染质粒在细胞内的表达是否均一；一部分用作后续的免疫共沉淀实验，加入0.4～1 μg抗体(抗FLAG抗体或抗PKCθ抗体)，4℃转动结合过夜，再加入25～50 μL蛋白G琼脂糖珠，4℃转动结合3 h；接着用细胞裂解液冲洗3次，每次15 000 r/min离心3 min，最后一次吸去上清，再加入等量的2×SDS加样缓冲液，于95℃变性10 min，离心后取上清；进行SDS-PAGE，转膜至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中室温封闭1 h；加入用4%BSA以一定比例(1∶1 000～1∶2 500)稀释的一抗(抗FLAG抗体、抗cMyc抗体或抗PKCθ抗体)，4℃轻摇过夜，TBST中洗膜3次，每次10 min；加入用5%脱脂奶粉以一定比例(1∶10 000～1∶50 000)稀释的二抗，室温轻摇1 h，TBST中洗膜3次，每次10 min；用化学发光法显色，X光胶片显影。

2 结果与分析

2.1 UFDS系统及突变体的构建与鉴定

根据Rainer Niedenthal的方法，通过PCR扩增构建了FLAG-Ubc9-PKCθ表达质粒，即UFDS系统。然后，应用Abgent公司的在线预测蛋白质SUMO化修饰位点的软件SUMOplotTM分析，发现PKCθ上有多个潜在的能与SUMO分子结合的赖氨酸(K)位点，其中预测分高于0.8的有7个：K325、K376、K412、K261、K506、K227和K656(表2)。利用Strategene公司的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，设计特定的单点突变引物将该点的碱基A突变为G(AAA/AAG→AGA/AGG)，从而该点编码的赖氨酸突变为精氨酸(K→R)；如图1(彩图见图版六)所示，通过PCR扩增构建单点突变的FLAG-Ubc9-PKCθ，在此基础上依次再进行单点突变，构建两点、三点、四点、五点或六点同时突变的FLAG-Ubc9-PKCθ；测序和序列比对的结果表明赖氨酸都突变成了精氨酸，FLAG-Ubc9-PKCθ缺失SUMO化修饰的突变体构建成功。

表2 SUMOplotTM预测PKCθ潜在SUMO化修饰位点的得分表Table 2 The score table for potential sumoylation sites of PKCθ predicted by SUMOplotTM.

图1 FLAG-Ubc9-PKCθ缺失SUMO化修饰突变体(K→R)的测序与比对结果Fig.1 Sequencing and alignment analysis of sumoylation deletion mutant (K→R) FLAG-Ubc9-PKCθ.

将野生型或缺失SUMO化修饰的突变型FLAG-Ubc9-PKCθ分别转染入293T细胞，24 h后收集细胞蛋白并进行Western印迹检测。结果显示用抗FLAG抗体检测到特异性蛋白条带，大小约为100 kDa(Ubc9的分子量约为18 kDa，PKCθ的分子量约为82 kDa),说明野生型和缺失SUMO化修饰的突变型FLAG-Ubc9-PKCθ，即UFDS系统均在293T细胞中得到表达(图2)。

图2 野生型和缺失SUMO化修饰突变型FLAG-Ubc9-PKCθ的表达Fig.2 Expression of wild type and sumoylation deletion mutant FLAG-Ubc9-PKCθ.

2.2 应用UFDS系统检测PKCθ的SUMO化修饰

我们将野生型或SUMO化修饰的突变型FLAG-Ubc9-PKCθ和cMyc-SUMO1质粒共同或分别单独转染293T细胞，48 h后收集细胞蛋白用抗FLAG抗体免疫沉淀，然后分别用抗cMyc抗体和抗FLAG抗体进行Western印迹检测。

如图3所示，当FLAG-Ubc9-PKCθ与cMyc-SUMO1共转时，有几条迁移率较慢的条带可被抗cMyc抗体和抗FLAG抗体同时识别，其中略高于175kDa的条带最为明显，其分子大小相当于2个或3个cMyc-SUMO1(32.5kDa)和FLAG-Ubc9-PKCθ(100kDa)的两者之和(泳道5)，而当FLAG-Ubc9-PKCθ或cMyc-SUMO1单转时并没有相应的共价结合的条带出现(泳道1～2)，说明Ubc9-PKCθ能够被SUMO1修饰，且可能存在多个修饰位点。

我们选择的突变型是多个SUMO化修饰位点同时突变的FLAG-Ubc9-PKCθ：4KR(K261/325/376/412R)、5KR(K261/325/376/412/506R)、6KR-1(K227/261/325/376/412/506R和6KR-2(K261/325/376/412/506/656R)。如图3、4所示，与野生型FLAG-Ubc9-PKCθ 相比，四点同时突变时，检测到的与 SUMO1 结合的条带有所减弱(图3泳道5、6)，五点同时突变时，条带减弱的程度更加明显(图3泳道5、7)，直到六点同时突变时，才检测不到迁移率较慢的 SUMO 化修饰条带(图4泳道4～6)，再次说明Ubc9-PKCθ能够被SUMO1修饰，且可能存在多个修饰位点。

图3 野生型和四点、五点同时突变型Ubc9-PKCθ的SUMO化修饰Fig.3 Sumoylation of wild type, four-point and five-point mutant Ubc9-PKCθ.

图4 野生型和两种六点同时突变型Ubc9-PKCθ的SUMO化修饰Fig.4 Sumoylation of wild type and two types of six-point mutant Ubc9-PKCθ.

为了进一步验证UFDS系统的检测结果，一方面，本研究将去SUMO化酶FLAG-SENP1与或不与FLAG-Ubc9-PKCθ、cMyc-SUMO1共同转染293T细胞,48 h后收集细胞蛋白用抗PKCθ抗体免疫沉淀，然后分别用抗cMyc抗体和抗PKCθ抗体进行Western印迹检测；如图5所示，当FLAG-SENP1与FLAG-Ubc9-PKCθ、cMyc-SUMO1共表达时，不能检测到那条略高于175kDa的条带，证明其确实是SUMO1修饰ubc9-PKCθ的条带。另一方面，本研究在293T细胞中单转或共转野生型或六点同时突变型FLAG-PKCθ和cMyc-SUMO1，48 h后收集细胞蛋白用抗FLAG抗体免疫沉淀，然后分别用抗cMyc抗体和抗FLAG抗体进行Western印迹检测；如图6所示，与野生型FLAG-PKCθ 相比，六点同时突变时，检测不到迁移率较慢的 SUMO 化修饰条带，说明PKCθ能够被SUMO1修饰，且可能存在多个修饰位点，与UFDS系统检测结果相符合。

图5 SENP1导致Ubc9-PKCθ去SUMO化修饰Fig.5 SENP1 leading to desumoylation of Ubc9-PKCθ.

3 讨论

作为一类重要的蛋白质翻译后修饰分子，SUMO被发现已有十余年时间，近些年关于SUMO化修饰的研究发展快速。SUMO对底物蛋白的修饰过程涉及一系列酶促级联反应：ATP存在时，SUMO首先被活化酶活化，随后被转移到结合酶Ubc9上，最后在连接酶的促进下SUMO从Ubc9转移到底物蛋白上。与泛素化过程中存在有多个泛素结合酶不同，Ubc9是SUMO化过程中唯一的SUMO结合酶，具有足够的直接将SUMO转移到底物蛋白并修饰底物蛋白的能力[6]。并且，由于Ubc9和泛素的表面大多带正电，SUMO的表面大部分为负电荷，故Ubc9不能与泛素结合，只能与SUMO结合，Ubc9对SUMO是特异的[7]。基于Ubc9的以上特点，我们分析，Rainer Niedenthal团队提出的UFDS系统是Ubc9融合表达介导的SUMO化修饰检测系统，Ubc9与底物蛋白的融合表达能大大地增加SUMO转移到底物蛋白并修饰底物蛋白的可能性，并且这种可能性只针对SUMO[3～5]，因此我们认为UFDS系统作为检测SUMO化修饰靶蛋白的方法是具有理论基础的。

图6 野生型和两种六点同时突变型PKCθ的SUMO化修饰Fig.6 Sumoylation of wild type and two types of six-point mutant PKCθ.

PKCθ是免疫细胞内重要的蛋白激酶，已知其活性和功能能通过多个氨基酸位点可逆的磷酸化修饰来调节[8～13]。而PKCθ上有多个赖氨酸位点，通过已知的SUMO化修饰位点的特点及SUMO化修饰形式的共性，我们利用生物信息学软件预测了PKCθ上可能的SUMO化修饰位点。预测结果显示，PKCθ上一共有15个赖氨酸可能是SUMO化修饰位点，其中有7个赖氨酸的评分都很高，均在0.8分以上，从预测位点数量和评分高低都提示PKCθ能被SUMO化修饰的可能性极大，因此我们选用PKCθ作为应用UFDS系统检测SUMO化修饰的靶蛋白。

UFDS系统与普通方法得出的结论一致，即PKCθ与或不与Ubc9融合表达都能检测到被SUMO化修饰，说明UFDS系统检测SUMO化修饰的可行性。在鉴定SUMO化修饰位点时，虽然UFDS系统与普通方法得出的结论一致，但普通方法中完全检测不到六点突变的PKCθ与SUMO结合的条带，而UFDS系统中依然能检测到六点突变的PKCθ与SUMO结合的条带，只是相较于野生型PKCθ与SUMO结合的条带要显著的减弱，说明UFDS系统鉴定SUMO化修饰位点的精确性不够，我们分析，这可能是Ubc9的融合表达使PKCθ与内源性SUMO的稳定结合也放大了。因此，通过我们的验证可以得出结论，UFDS系统能使靶蛋白可能发生的 SUMO 化修饰更易检测，但也有一定的缺陷，人为增强可能导致产生假阳性及无法鉴定具体的修饰位点。UFDS系统为细胞内(外)筛选SUMO化修饰靶蛋白提供了可行的技术手段，但寻求更加精确、更加完善的方法仍然迫在眉睫。