南药益智SRAP-PCR体系优化及引物筛选

欧虹雅, 韩冬苗, 黄兹宝, 张明康, 周聪聪, 高炳淼

海南医学院药学院, 海口 571199

益智(AlpiniaoxyphyllaMiquel)为姜科山姜属植物，其果实为常用中药益智仁，味辛、性温，具有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾的功效[1,2]。野生益智主要生长于雨量充足、气候湿润的山坡林地。目前，益智的种植方式主要为人工栽培，常种植于海南岛各山区或人工橡胶林下，此外，在广东、广西、云南、福建等地也有少量的种植[3]。益智的化学成分主要为萜类、黄酮类、二苯基庚烷类、酚类、甾醇类等，其中，倍半萜类、二苯基庚烷类是其重要活性成分[4～6]。现代药理学研究表明，益智具有抗癌、强心、舒张血管、镇静、镇痛、抗过敏、抗衰老、抗氧化、提高免疫力、保护神经细胞等多方面的药理活性[7～9]。

海南岛地处中国最南端，位于热带和亚热带，拥有独特的气候和地理环境，药用植物资源丰富。全岛已知的药用植物资源达3 100种以上，其中，1 000多种被《全国中草药汇编》收录，135种载入《中国药典》[10]。近几年，随着益智药食功能的开发，市场需求量不断增加，使人们开始无节制的采挖益智，导致野生益智资源逐年减少。因此，保护南药益智资源刻不容缓。随着分子遗传学的快速发展，基于PCR技术的各种分子标记技术得到了广泛应用，并且因其简单易行、快速准确、重现性好、成本低、抗污染等优点，具有十分广阔的应用前景[11]。序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记技术已被广泛应用于药用植物种质资源的鉴定、药用植物的分子机制和遗传多样性的研究，并成为被相关研究人员使用的热门技术之一[12,13]。SRAP标记的优点是将扩增片段长度多态性(amplified fragment length olymorphism，AFLP)标记和随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)标记有机地结合在一起，具有简单稳定、产量中等、高频共显性的优势，同时，该方法与其他方法相比，如RAPD标记、AFLP标记、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记，更能反映表型多样性和进化历史，故成为近年来比较流行的分子标记技术之一[13,14]。

本研究以南药益智为材料，采用L16(45)正交试验优化并建立适用于南药益智的SRAP-PCR体系，再以优化后的SRAP-PCR体系筛选引物，以期为南药益智的遗传多样性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料 22份样品材料均为采集于海南不同地理居群的益智的新鲜叶片，采收后使用硅胶干燥，室温保存。全部样品经海南医学院潘坤副教授鉴定为姜科植物益智。

1.1.2实验试剂Taq酶、Mg2+、dNTPs、DNA Marker D2000、RNaseA和植物基因组DNA提取试剂盒均来自天根生化科技(北京)有限公司；SRAP引物由深圳华大基因科技有限公司合成；琼脂糖(Biowest Agarose)购自海南合辉实业有限公司；核酸染料(Goidview)购自上海赛百盛公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3实验仪器 WD-9402B型PCR扩增仪(北京六一生物科技有限公司)；HYQ-2110型微型涡旋混匀器(美国精骐有限公司)；DYY-6D型电泳仪电源(北京六一生物科技有限公司)；核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)；HH-3型恒温水浴锅(邦西仪器科技(上海)有限公司)；DYCP-31DN型SDS-电泳槽(北京六一生物科技有限公司)；SIGMA 1-14微型离心机(德国Sigma公司)；Tanon 4100凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.2 益智DNA提取及其浓度、纯度检测

将采集的22份益智样品经酒精消毒后，剪碎放入已灭菌的钵体中，添加液氮迅速研磨后，称取100 mg装到离心管中，然后根据植物基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取其DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度，用核酸蛋白测定仪检测其纯度。

1.3 SRAP-PCR反应体系优化

采用L16(45)正交试验(表1)对Taq酶、dNTPs、Mg2+、引物、DNA模板5个影响因素进行优化。然后，随机挑选1对SRAP引物(引物序列见表2)，以最优反应体系进行PCR扩增，反应程序为94℃ 3 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，共5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5 min。最后，将PCR产物置于4℃保存。

1.4 SRAP-PCR特异性引物筛选

将合成的正、反向引物(各12条)进行自由组合，得到144对随机配对引物，利用最优SRAP-PCR反应体系从中筛选出扩增效果良好的引物。

表1 正交试验L16(45)设计表Table 1 The table of orthogonal test L16 (45) design.

表2 SRAP-PCR所用引物Table 2 Primers used in SRAP-PCR.

2 结果与分析

2.1 益智DNA样品提取及其浓度、纯度检测

采用植物基因组DNA提取试剂盒提取22份来自海南不同地理居群的益智基因组DNA，提取的DNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，DNA条带均明亮、整齐且未见明显降解。经核酸蛋白测定仪检测，A260/A280比值均在1.8～2.0之间，表明RNA和蛋白质去除较为完全。结合电泳鉴定结果和A260/A280比值可以确定，提取的益智基因组DNA满足SRAP-PCR对DNA质量的要求。

2.2 SRAP-PCR反应体系优化

采用正交试验优化SRAP-PCR扩增过程中的各影响因素，以表1中的16个反应体系进行SRAP-PCR，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)。正交试验结果分析如表3所示，由此得出各因素影响顺序：Mg2+>TaqDNA聚合酶>DNA模板=dNTPs>引物，其中，Mg2+以2 mmol/L为佳，TaqDNA聚合酶以0.25 U或0.5 U为佳，DNA模板以10 ng为佳，dNTPs以2 mmol/L最佳，引物以1 μmol/L或4 μmol/L为佳。结合电泳鉴定结果，判断最优反应体系为7号，扩增后条带大小在100～2 000 bp之间，且条带数最多。

图1 益智基因组DNA提取样品鉴定Fig.1 The electrophoresis result of extracted Alpinia oxyphylla Mique genome DNA samples.

图2 正交实验优化SRAP-PCR体系Fig.2 The optimization of SRAP-PCR system by orthogonal test.

表3 正交结果分析Table 3 Analysis of orthogonal results.

因此，最优反应体系(总体积为25 μL)为：Taq酶 0.5 U，dNTPs 4 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物各 2 μmol/L，DNA模板10 ng，10×PCR buffer 2.5 μL。

2.3 引物初筛与多态性分析

将正、反向引物(各12条)自由组合，得到144对引物，以最优反应体系进行PCR扩增，利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物后，获得24对引物(图3)。再对初步筛选出的24对引物的多态性条带数和多态率进行分析，由表4可知，总条带数为164条，其中多态性条带数为138条，平均总多态率达84.1%。由24对引物扩增出的总条带数最多达11条，最少为4条，平均每对引物的扩增条带数为6.83条，平均多态性条带数为5.75条。多态率在85%以上的引物共有11对：f1r2、f6r12、f8r1、f9r1、f9r10、f9r12、f10r2、f10r10、f10r11、f12r6、f12r11，其中f9r10和f10r11的多态率为100%。结合扩增产物多态性分析和琼脂糖凝胶电泳的结果，获得7对适合南药益智的SRAP-PCR扩增引物，分别为f8r1、f9r1、f9r10、f10r2、f10r10、f10r11、f12r6。最后，以f10r11引物为例对不同地理居群的益智基因组DNA样品进行SRAP-PCR扩增，结果表明筛选获得的引物能够满足南药益智遗传多样性的分析需求(图4)。

图3 SRAP-PCR引物筛选电泳结果Fig.3 The electrophoresis result of primers screened by SRAP-PCR.注：M：Marker；1～24：不同引物(与表4中的编号相对应)的SRAP-PCR扩增产物。

表4 SRAP-PCR扩增产物多态性分析Table 4 The polymorphic analysis of SRAP-PCR amplified products.

图4 不同地理居群的益智基因组DNA SRAP-PCR鉴定结果Fig.4 The SRAP-PCR identification result of Alpinia oxyphylla Miquel genomic DNA in different geographical groups.

3 讨论

近年来，随着分子生物学的快速发展，分子标记技术在植物学研究中得到了广泛而深入的应用。DNA分子标记技术是建立在药用植物遗传物质的基础上，其结果不受环境条件、样品形态和物质来源的影响，可为药用植物资源的研究提供更准确、可靠的信息[15]。刘晓静[16]应用简单重复序列间扩增(inter simple sequence repeat，ISSR)分子标记方法对采自海南和广东的7个野生益智居群进行遗传多样性分析。邹颖[17]采用SSR标记技术对所采集到的不同地理居群的益智样品进行了遗传多样性、遗传结构和居群亲缘关系的研究。高炳淼等[18,19]利用正交设计方法对益智的AFLP-PCR和ITS-PCR的扩增条件进行了优化。

SRAP标记是近年来发展的一种基于PCR的分子标记技术[11]，已在大黄[20]、甘草[21]、人参[22]、石斛[23]等中药的研究领域得到了广泛的应用。但是，尚无该技术在益智研究中应用的报道。本试验紧密结合海南省南药产业化发展的实际情况，针对南药益智野生资源不断受到破坏、其栽培品质不断下降等问题进行研究，为野生益智种质资源保护、鉴定和评价提供了科学依据，同时也为海南益智的中药材生产质量管理规范(good agricultural practices，GAP)种植基地进行种质资源筛选和药材地道性评价提供了理论基础。

本研究利用正交试验优化SRAP-PCR反应中的影响因素，从而快速、省时地获得了最优PCR扩增体系，同时避免了单因素试验不能兼顾各因素间的交互作用的问题。正交实验结果表明，TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物、DNA模板等对SRAP-PCR扩增均有一定的影响，其影响顺序为Mg2+>TaqDNA聚合酶>DNA模板=dNTPs>引物。首先，Mg2+对益智SRAP-PCR体系的影响最大，高浓度Mg2+易影响酶的活性、扩增的可靠性及特异性，而低浓度Mg2+会影响扩增产量甚至导致无法扩增出条带。其次，TaqDNA聚合酶的量过低可导致PCR反应不完全，而过高又会增加非特异性产物，所以TaqDNA聚合酶的用量也是关键。再者，DNA模板和dNTPs两者对反应体系的影响程度相当。高浓度dNTPs会导致TaqDNA聚合酶的复制出现错误，非特异性产物增多；而低浓度会造成过早用完原料，达不到理想的扩增效果。同样地,DNA模板浓度过高可导致非特异性产物增多，而浓度过低又会使扩增产物较少。最后，在本研究结果中，引物浓度对SRAP-PCR反应体系的影响较小。本试验各因素对反应体系的影响顺序与唐古特大黄[20]的研究结果相似，其与本试验不同的是引物和dNTPs的影响顺序，这可能是DNA模板差异导致的。本研究通过正交实验得出SRAP-PCR反应扩增的最优反应体系(总体积25 μL)：TaqDNA聚合酶0.5 U，dNTPs 4 mmol/L，Mg2+2 mmol/L，引物各2 μmol/L，DNA模板10 ng，10×PCR buffer 2.5 μL。

引物序列是SRAP-PCR扩增过程中的关键，即使建立了最优PCR扩增体系，倘若引物没有良好的选择性和特异性，也无法获得准确的实验结果。因此，在获得最优PCR扩增体系的基础上，本研究对144对引物进行了大量的筛选工作。从中初步筛选出24对引物，再对这些引物进行SRAP-PCR的多态性数据分析，得出益智总条带数为164条，其中多态性条带数达138条，多态率为84.1%。最后，筛选出7对特异性引物，其扩增产物片段大小均在100～2 000 bp以内且分布较均匀，多态性条带比率皆达85%以上。

本研究通过正交试验对SRAP-PCR体系各影响因素进行优化，建立了最优的适用于南药益智的SRAP-PCR体系。又利用最佳SRAP-PCR体系对特异性引物进行筛选，获得7对适用于益智遗传多样性分析的引物，为南药益智的遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析、遗传图谱构建等奠定了基础。