激光透明带薄化技术在冻融胚胎和高龄妇女新鲜胚胎移植中的应用研究

石 燕，葛 斌，杨智敏，杨 靖，杨名慧（遵义医学院附属医院生殖中心，贵州遵义563003）

随着辅助生殖技术的不断发展和完善，如何提高胚胎的种植率和妊娠率是现阶段的热点问题。胚胎从透明带中顺利孵出是着床的先决条件。已有研究发现，胚胎在冻融和体外培养过程中均会产生透明带变厚、变硬的情况，从而导致胚胎孵出困难[1]。激光透明带薄化术是一种辅助孵化技术，其原理是使用激光将透明带削薄，有利于胚胎从透明带中孵出，进而着床的一种显微操作技术[2]。而该技术在操作过程中激光产生的热能是否会对胚胎卵裂球产生损伤，导致流产率增加，目前尚存争议。本研究回顾性分析激光透明带薄化技术对冻融胚胎和高龄妇女新鲜胚胎临床结局的影响，以探讨此技术在胚胎移植中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2016年11月在本中心进行冻融胚胎移植和新鲜胚胎移植患者冻融胚胎179周期共胚胎406枚作为研究对象，其中117周期共263枚胚胎行透明带薄化技术，其余62周期共143枚胚胎未行透明带薄化术；高龄妇女（≥37岁）新鲜胚胎84周期共217枚胚胎，其中52周期共135枚新鲜胚胎行激光透明带薄化术，32周期共82枚胚胎未行削薄术，按照是否行激光透明带薄化术分为薄化组合对照组，并排除子宫肌瘤、生殖系统畸形、染色体异常等影响胚胎着床或造成流产的因素。

1.2 方法

1.2.1 促排卵与取卵 采用本中心常规长方案、短方案或拮抗剂进行促排卵，最大卵泡直径大于或等于18 mm，其余有3个卵泡直径大于或等于16 mm，子宫内膜厚度大于或等于8 mm时，当天停用促卵泡发育药物，注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）10 000 U，36 h后在阴道B超下穿刺取卵。

表1 两组一般资料比较

表2 两组高龄妇女新鲜胚胎比较

1.2.2 体外受精与移植 根据精液情况和适应证进行常规体外受精（IVF）或单精子卵胞质内注射（ICSI）操作，受精后66～68 h进行胚胎移植，剩余胚胎冷冻保存。

1.2.3 胚胎冷冻与复苏

1.2.3.1 胚胎冷冻 冷冻试剂采日本KITAZATO玻璃化试剂盒；冷冻方法：将胚胎转移到羟乙基哌嗪乙硫黄酸（HEPES）缓冲液停留1 min，然后在平衡溶液中脱水2 min，最后转移至玻璃化溶液停留30 s后装载到载杆上直接投入液氮中保存。

1.2.3.2 胚胎复苏 将胚胎从液氮罐中取出以此放入0.5 mol/L蔗糖溶液和0.35 mol/L蔗糖溶液中各停留1 min，再转移至0.25 mol/L蔗糖溶液中反脱水3 min，最后在HEPES缓冲液中洗涤数次，放置于37℃、5%CO2培养箱中。

1.2.3 激光透明带薄化技术 将胚胎置于覆盖矿物油的培养滴内，在倒置显微镜下使用美国Hamilton Thorne公司生产的ZILOS-TK激光显微操作系统，先测量透明带的厚度，然后发射1 480 nm波长红外激光进行透明带薄化处理。削薄胚胎透明带厚度的70%～80%直至内侧致密层，每次薄化长度设定为7.1～7.5µm，总薄化长度约为透明带周长的1/4，操作结束后将胚胎洗涤数次后置于培养箱内待移植。

1.2.4 妊娠判定 移植后14 d检查HCG，若为阳性于25～35 d进行B超检查孕囊，并随访直至分娩。

1.2.5 观察指标 胚胎种植率=种植胚胎总数/移植胚胎数×100%；妊娠率=妊娠周期数/总周期数×100%；流产率=流产周期数/妊娠周期数×100%。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件对数据进行数据分析，组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组平均年龄、子宫内膜厚度、移植个数和流产率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；而薄组种植率和妊娠率均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组高龄妇女新鲜胚胎比较 两组间平均年龄、子宫内膜厚度、移植个数和流产率，差异均无统计学意义（P＞0.05），薄化组种植率和妊娠率均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨 论

胚胎是否能从透明带中顺利孵出是决定辅助生殖成功率的重要条件。在自然受孕过程中，胚胎孵出主要依赖于滋养细胞和消化蛋白酶溶解透明带而完成，而在促排卵、体外受精和胚胎冷冻过程中，由于胚胎长时间暴露在体外环境中，尤其是冻融胚胎移植患者和高龄妇女，温度、湿度等剧烈变化会造成透明带变厚、变硬或畸形，从而导致胚胎孵出困难，严重影响辅助生殖的成功率[3]。

激光透明带薄化术是近年来新兴的一种辅助孵化技术，相对于透明带钻孔术而言，具有防止卵裂球污染、丢失、嵌顿、免疫学疾病等优点[4]。本研究在观察冻融胚胎患者中，排除年龄、子宫内膜厚度、移植个数等影响胚胎临床结局的因素，发现行激光透明带薄化术的胚胎其种植率和妊娠率均显著高于对照组，与谷瑞环等[5]的研究结果一致，但 VALOJERDI等[6]和陈曦等[的研究结果相反，分析其原因可能为：（1）由于研究对象的临床情况、胚胎质量和冷冻方法的差异而导致的结果不同；（2）由 VALOJERDI等[6]在研究过程中，只削薄了透明带的外层，而导致胚胎孵出困难的致密层却完整保留。本研究对透明带厚度的削薄范围达到了70%～80%，并且只保留了1/3的致密层，因此导致试验结果有差异。

在对高龄妇女新鲜胚胎的研究中，薄化组种植率和妊娠率均显著高于对照组，与邓志华等[8]研究结果不同，但与张建瑞等[9]的研究结果一致，除了样本量、胚胎质量和患者激素存在差异外，最可能的原因是高龄妇女的胚胎发育潜能、孵出能力比较差，即使行激光透明带薄化术也不能显著改善其临床结局。

国外有学者研究认为，激光透明带削薄术并不能提高非高龄妇女新鲜胚胎的妊娠率[10]。因此，本中心暂时未对此类型妇女新鲜胚胎进行常规的透明带削薄术。MARTINS等[11]和唐永梅等[12]研究发现，基础促卵泡生成激素（FSH）值和胚胎碎片含量对新鲜胚胎的孵出也有影响，本中心下一步将对FSH值大于15 U/mL、胚胎碎片大于20%和反复移植失败的非高龄妇女新鲜胚胎行激光透明带削薄术，以进一步明确该技术对此类患者临床结局的影响。

在激光透明带削薄术操作中，削薄的位置和长度是十分重要的，但要注意削薄的位置，应尽量远离卵裂球，从而最大限度地避免卵裂球不被激光的热量灼伤，且削薄的长度要足够长，一般为80µm，以避免孵出时形成嵌顿。

综上所述，激光透明带薄化技术能有效改善冻融胚胎的临床结局，且不会增加流产风险。虽然本研究结果显示，该技术能显著增加高龄妇女新鲜胚胎移植结局的影响，但由于样本量较小，其效果仍需加大样本量做进一步研究。