峨眉山不同海拔高度3种竹叶片结构特征变化研究

蒋 琴,龙文聪,2,刘安萱,2,肖析蒙,2,刘远志，李晨昊，杨瑶君

(1.乐山师范学院 竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室，四川 乐山 614000；2.西华大学 食品与生物工程学院， 四川 成都 610039)

四川是竹子的主要产地[1]。不同海拔区域分布不同竹品种，不同竹种其形态学特征、生理生化特征及地上生物量等对海拔响应是非线性的[2-3]。海拔垂直变化地带是研究植物对气候变化响应的理想区域[4]。峨眉山具有典型的垂直气候特征[5]，是研究竹叶特征受海拔影响较合适的地区。叶片改变形态及结构来响应环境变化，其结构特征最能反映环境因子与植物的共同进化[2]。比叶面积是单位叶面积与质量的比值，也是研究植物叶片重要的性状之一[6-7]。有关于海拔对草本及木本植物叶片形态和解剖结构影响报道较多[3,8-17]，关于海拔梯度上竹类叶片形态、结构变化的研究报道尚不多见。姜永雷等[8]研究了不同海拔川滇高山栎叶片的解剖结构特征；李蟠等[9]研究不同海拔贡嘎山冷杉比叶面积和非结构性碳水化合物含量变化的研究表明，随海拔升高，比叶面积减小；何涛等[10-11]综合分析了青藏高原高山植物的形态和解剖结构及其对环境的适应性研究进展，比较了不同海拔火绒草叶绿体超微结构；李全发等[12]研究了青藏高原草地植物叶解剖特征；孙会婷等[13]开展了青藏高原不同海拔3种菊科植物叶片结构变化及其生态适应性的研究；潘红丽等[2,18]研究卧龙油竹子形态学特征、地上部生物量以及生理生态特征对海拔的响应，发现油竹子的生长受降水以及不同海拔环境影响较大，其中竹组织中叶比枝、干及根对海拔变化更敏感；Liu等[19]研究缙云山的斑苦竹在不同水分条件下的形态可塑性；吴杰等[3，14]在对卧龙林下小径竹生理生态特性比较研究表明，油竹子和华西箭竹生长季前比叶面积在海拔上呈非线性变化同时对卧龙竹类非结构性碳水化合物与叶氮含量对海拔的响应进行了研究。根据李振宇等[20]、陈绪玲等[21]的研究以及笔者实地踏查，慈竹(Neosinocalamusaffinis)、八月竹(Chimonobambusaszechuanensis)和短锥玉山竹(Yushaniabrevipaniculata)在峨眉山不同海拔广泛分布，分别为600～1 000 m的低山竹、1 600～2 400 m的半山竹、2 500～3 000 m的高山竹。本文以此3种在不同海拔高度广泛分布的代表性竹为研究对象，采用统计分析和电镜扫描技术，旨在研究以下2个问题：(1)竹叶片形态、解剖结构随海拔变化的特点和规律；(2)竹叶片解剖因子的可塑性与海拔的关系。以期为深入研究竹类对环境的适应性提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究地概况

峨眉山位于四川盆地向青藏高原的过渡地带(29°31′～38′N，103°15′～28′E)，大部分地形属于剥蚀背斜褶皱断块山，属于中亚热带季风气候区域，年均气温为17.29 ℃，海拔落差2 700 m，最大温差可达14 ℃。峨眉山具有典型的垂直气候特征，其生物气候垂直带明显，海拔1 800 m以下为常绿阔叶林带，海拔1 800～2 200 m为常绿阔叶林与落叶阔叶混交林带，海拔2 200～2 600 m为针阔混交林带，海拔2 600 m以上为针叶林带[5,20-22]。

1.2 实验材料

采集慈竹、八月竹、短锥玉山竹3种竹新鲜成熟叶片，以经历旺盛生长季后11月初期的竹叶片进行研究。海拔高度100 m设置1个样地，每个样地的坡向、坡度等基本一致。参照孙会婷等[13]的方法，每个样地随机选取10 株发育程度相近的成熟植株，在植株中部相同的位置采集健康成熟的叶片3片、共计30片进行表型统计，然后随机选取5片，在叶片中部以主脉为中心剪取5 mm×5 mm大小放入FAA固定液中固定(体积分数为70%乙醇90 mL、甲醛5 mL、冰乙酸5 mL的混合液)，带回实验室后放入4 ℃冰箱保存。植物采集地点、海拔高度信息见表1。

表1 竹子类型及其海拔高度

1.3 实验方法

1.3.1叶片表型特征测量 叶片采集后即用精确度为0.01 mm的游标卡尺测量叶片的长度与宽度。叶片长度(以下简称叶长)是指叶片最大长度，叶片宽度(以下简称叶宽)是指叶片最大宽度，长宽比即叶长和叶宽的比值。叶面积是将采集的叶片经扫描后用Image J软件测定。比叶面积是叶面积与干叶质量的比值，以叶长、叶宽、长宽比、叶面积及比叶面积的算术平均数进行统计分析。

1.3.2扫描电镜观察 电镜扫描样品制作方法参考王伟中等[23]的方法，将FAA固定液中的样品快速取出，放入体积分数为4%戊二醛固定液，在4 ℃下固定2 h，磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1)冲洗样品3次，经体积分数为30%、50%、70%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水三次，每次用乙酸异戊脂置换15 min，再经二氧化碳临界干燥，离子溅射仪镀金属膜后在InspectF 50型扫描电镜下观察叶片断面及下表面并拍照。用Image J软件测量统计叶片厚度、维管束长度、维管束宽度、上表皮厚度、下表皮厚度等5项指标及气孔密度、气孔面积等2个指标，每项指标重复测量10次，并计算出他们所对应的可塑性指数(PI)。本文中对竹叶片解剖结构进行描述的专业术语参考陈守良等[24-25]。

1.4 数据处理

利用Excel软件(2016)对数据进行统计和作图，利用SPSS 19.0软件进行方差分析和相关性分析。差异显著性分析用Duncan′s检验方法，P<0.05为差异显著。相关性分析用双侧检验，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同海拔叶片表型特征变化

经测定，对峨眉山3种竹叶片表型特征比较的结果如表2所示，3种竹叶片的表型特征对海拔梯度响应的变化趋势不同。

2.1.1慈竹 慈竹的叶长、叶宽、叶面积、比叶面积随海拔升高呈现出不同的变化趋势，叶长、叶面积峰值出现在海拔700 m；叶宽、比叶面积峰值在海拔600 m；海拔900 m叶长、叶宽、比叶面积均为最低。慈竹叶长、叶宽、叶面积和比叶面积均与海拔高度呈极显著负相关(相关系数r分别为-0.590、-0.569、-0.282、-0.508，P<0.01)；叶片长宽比随海拔升高呈上升趋势，与海拔高度呈极显著正相关(r=0.336**，P<0.01)。

2.1.2八月竹 八月竹叶长、叶面积随海拔升高整体呈下降趋势，海拔1 600 m叶长值20.27 cm、叶宽2.63 cm均为最大，叶面积和比叶面积也最大；分布区域上限(海拔2 400 m处)，其叶长、叶宽、叶面积、比叶面积均大幅度降至最低值。经统计分析，八月竹的叶长、叶宽、叶面积、比叶面积与海拔高度存在极显著负相关(相关系数r分别为-0.780、 -0.652、-0.705、-0.642，P<0.01)；叶长宽比与海拔无显著相关性(r=-0.126,P=0.091)。

表2 慈竹、八月竹、短锥玉山竹叶片不同海拔的表型特征比较

说明：同一列不同小写字母表示在0.05水平下差异显著

2.1.3短锥玉山竹 短锥玉山竹叶长、叶宽随海拔升高呈下降趋势明显，叶面积和比叶面积随海拔升高波动较大。叶长、叶宽、叶面积、比叶面积峰值在2 500 m处最大，但在最低值并未全部出现在分布上限处。叶长、叶宽、叶面积、比叶面积与海拔高度有极显著的负相关关系(相关系数r分别为-0.726、-0.683、-0.313、-0.404，P<0.01)；叶长宽比与海拔无显著相关性(r=0.108,P=0.242)。

2.2 叶片超显微结构特征变化

通过扫描电镜观察发现，慈竹、八月竹和短锥玉山竹叶片均为等面叶，叶肉组织无栅栏组织和海绵组织的分化(图1～3)。其中3种竹叶表面的附属物等差异明显，慈竹叶片下表面可观察到裸露的气孔，而八月竹及短锥玉山竹气孔均被乳突所掩盖(图4、图8)。在不同海拔下，3种竹叶上、下表皮表面均有一层较厚的角质层，且上表皮厚度明显大于下表皮厚度。从叶片横断面均可观察到维管束，以及其周围的气腔结构。经测量分析表明，慈竹、八月竹和短锥玉山竹叶片的叶片厚度、维管束长度、维管束宽度以及上下表皮厚度的大小在不同海拔之间差异显著(P<0.05 )。对3种竹叶的超显微特征进行可塑性分析，结果表明3种竹均有较大的可塑性(表3)。

UE.上表皮Upper epidermis；LE.下表皮Lower epidermis；VB.维管束Vascular bundle；AC.气腔Air cavity1 000X，(1)600 m,(2)700 m,(3)800 m,(4)900 m,(5)1 000 m, 2 000X，(6)600 m,(7)700 m,(8)800 m,(9)900 m,(10)1 000 m图1 不同海拔高度慈竹叶片结构特征Fig.1 The leaf structure of N. affinis at different altitudes

指标Index可塑性指数 Plasticity index慈竹N. affinis八月竹C. szechuanensis短锥玉山竹Y. brevipaniculata叶片厚度Leaf thickness0.180.350.17维管束长度Vascular bundle length0.370.580.34维管束宽度Vascular bundle width0.580.410.31上表皮厚度Upper epidermis thickness0.160.320.24下表皮厚度Lower epidermis thickness0.190.390.36

说明：可塑性指数(PI=1-x/X，x为种群间最小平均数，X为种群间最大平均数

UE.上表皮Upper epidermis；LE.下表皮Lower epidermis；VB.维管束Vascular bundle；AC.气腔Air cavity(1)1 600 m,(2)1 700 m,(3)1 800 m,(4)1 900 m,(5)2 000 m,(6)2 100 m,(7)2 200 m,(8)2 300 m,(9)2 400 m图2 不同海拔高度八月竹叶片结构特征Fig.2 The leaf structure of C. szechuanens at different altitudes

UE.上表皮Upper epidermis；LE.下表皮Lower epidermis；VB.维管束Vascular bundle；AC.气腔Air cavity(1)2 500 m,(2)2 600 m,(3)2 700 m,(4)2 800 m,(5)2 900 m,(6)3 000 m图3 不同海拔高度短锥玉山竹叶片结构特征Fig.3 The leaf structure of Y. brevipaniculata at different altitudes

2.2.1慈竹 慈竹上表皮较光滑，附着物少，而下表皮附着物较多，下表皮附有长毛、刺毛等表皮毛及乳突，乳突排列整齐成列，气孔分布其中呈裸露。随海拔升高，长毛长度减小，表皮毛数量呈下降趋势，但乳突的排列愈加紧密，同时气孔周围的乳突距离缩小(图4)。气孔密度随海拔升高而增大，气孔面积则呈下降趋势(表4)。叶片结构由表皮、维管束及在维管束周围的许多大小不一明显的气腔结构组成(图1)。维管束长度(r=-0.835**，P<0.01)、宽度(r=-0.831**，P<0.01)与海拔呈显著的负相关关系；叶片厚度(r=0.448**，P<0.01)与海拔呈极显著正相关(图5)；上表皮厚度(r=0.175，P=0.532)和下表皮厚度(r=-0.298，P=0.280)与海拔之间的相关性不显著。慈竹维管束宽度在不同海拔高度下可塑性最大，其可塑性指数为0.58，其次是维管束长和下表皮厚度，叶片厚度及上表皮厚度可塑性指数分别为0.18和0.16，可塑性显著小于其他指标(表3)。

S .气孔stoma P.乳突Papilla；MH.大毛 Macro-hair；PH.刺毛Prickle-hair1 000X，(1)600 m,(2)700 m,(3)800 m,(4)900 m,(5)1 000 m, 2 000X，(6)600 m,(7)700 m,(8)800 m,(9)900 m,(10)1 000 m图4 不同海拔梯度慈竹叶下表皮Fig.4 Lower epidermis of the N. affinis at different altitudes

图5 不同海拔梯度慈竹叶片解剖结构数量指标变化Fig.5 The leaf anatomical quantitative index of N.affinis at different altitude注：不同小写字母表示在0.05水平下差异显著，下同。Note: The different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level, same as below

2.2.2八月竹 八月竹上表皮表面光滑，下表皮无长毛，但有刺毛(图2)；不同海拔高度叶片下表皮密布大小乳突，气孔器被乳突所掩盖(图8)。叶片厚度(r=0.464**，P<0.01)、上表皮厚度(r=0.491**，P<0.01)与海拔有显著的正相关关系；维管束长度(r=-0.899**，P<0.01)、宽度(r=-0.947**，P<0.01)与海拔有显著的负相关关系；下表皮厚度(r=0.100，P=0.514)与海拔之间相关性不显著(图6)。八月竹的维管束长度在不同海拔高度上可塑性最大，可塑性指数达0.58，叶片厚度、上下表皮厚度可塑性分别为0.35、0.32、0.39，整体可塑性明显大于其他两种竹(表3)。

表4 不同海拔高度慈竹的气孔密度及气孔面积

图6 不同海拔梯度八月竹叶片解剖结构数量指标变化Fig.6 The leaf anatomical quantitative index of C. szechuanensis at different altitudes

2.2.3短锥玉山竹 短锥玉山竹叶片上表皮较粗糙，有刺毛，下表皮有乳突，且乳突密度较八月竹高，气孔器被乳突掩盖(图8)。叶片厚度(r=0.400**，P<0.01)与不同海拔之间呈显著的正相关关系；维管束长度(r=-0.911**，P<0.01)、宽度(r=-0.835**，P<0.01)和上表皮厚度(r=-0.556**，P<0.01)、下表皮厚度(r=-0.652**，P<0.01)与海拔有显著的负相关(图7)。短锥玉山竹的下表皮厚度的可塑性最大达0.36，可塑性最小的是叶片厚度0.17，维管束长、宽的可塑性也较大(表3)。

图7 不同海拔梯度短锥玉山竹叶片解剖结构数量指标变化Fig.7 The leaf anatomical quantitative index of Yushania brevipaniculata at different altitudes

(1)(3) 1 600m(C. szechuanens);(2)(4) 2 500 m(Y. brevipaniculata). S.气孔stoma图8 不同海拔梯度八月竹及短锥玉山竹叶下表皮Fig.8 Lower epidermis of the C. szechuanensis and Y. brevipaniculata at different altitudes

3 结论与讨论

本研究发现慈竹、八月竹、短锥玉山竹3种不同海拔高度分布的竹种虽然叶片长、宽、叶面积及比叶面积的绝对值差异较大，但不同竹种间的叶宽比的差异却较小，受海拔的影响程度也明显不同。随分布范围内的海拔梯度变化，分布于低海拔区的慈竹叶长、叶宽、长宽比、叶面积及比叶面积均达到极显著差异水平，而分布于较高海拔区域的八月竹和短锥玉山竹的长宽比差异不显著，其中分布于半山区的八月竹除长宽比外的各项参数与海拔的相关性差异极显著。由此表明，随分布范围内的海拔梯度变化，不同竹种的叶片表型特征变化程度不同，同一竹种叶片的不同表型特征变化趋势和差异显著性不完全相同：分布于1 000 m以下低海拔区的慈竹叶片表型随海拔梯度变化差异极显著，其表型特征可塑性较强；分布于2 500～3 000 m海拔区的短锥玉山竹的叶面积、比叶面积最小，分布于中低海拔的八月竹、慈竹次之。根据Reich等[26]的研究，比叶面积小的植物通常叶片较厚而面积较小，叶片很大一部分都用于构建自我保卫构造，说明短锥玉山竹对逆境的忍耐性优于慈竹和八月竹。

3种竹叶片都是等面叶，无叶肉组织的分化，上、下表皮表面均有较厚的角质层，但3种竹叶片下表皮结构不完全相同，分布于600～1 000 m海拔的慈竹气孔裸露，分布于中高海拔的八月竹及短锥玉山竹气孔均被乳突掩盖。随海拔升高，叶下表皮乳突排列越来越紧密且与气孔距离越来越近，叶片厚度均与海拔梯度变化呈显著正相关，维管束长度、宽度均与海拔梯度变化呈显著负相关。此表明，不同竹种叶片通过增加叶下表皮乳突数量、乳突掩盖气孔、增加叶片厚度、减少维管束长宽度来适应高海拔条件下的逆境。

施海燕等[16]对青藏高原7种风毛菊叶片的研究结果以及戴叶辉等[27]对13种榕属植物的研究中提出的“在植物进化过程中异面叶比等面叶更适应高海拔环境”，与本研究结果存在差异，慈竹、八月竹及短锥玉山竹在峨眉山不同海拔均为优势物种。异面叶中发达的栅栏组织和海绵组织是植物对环境的一种适应，可保护叶片，竹类为等面叶在峨眉山广泛分布，这可能竹子为典型的克隆植物、异质生境适应能力突出的特殊属性有关[28]。气孔被乳突所掩盖可减少水分散失，是中高海拔竹种应对干旱环境胁迫的结果。3种竹叶片厚度随海拔升高而显著升高，叶片小而厚是对强光、低温的适应，这与姜永雷等[8]，王元元等[15]，施海燕等[16]，李芳兰等[17]的结果一致。

根据Gratani等[29]对叶片可塑性的研究表明，可塑性在对环境的适应性中是有利的，可塑性大的植物，其分布更广泛。从本研究结果可知：八月竹叶片结构多数指标的可塑性指数均优于慈竹和短锥玉山竹，此表明八月竹对海拔梯度变化具有较强的可塑性和逆境适应性，这可能是八月竹在中高海拔地区分布多而广的原因。慈竹在海拔1 000 m以下主要表型特征随海拔梯度变化极显著变化，表现出较强的表型特征可塑性，可能是他们在四川低海拔区域分布数量较多的重要原因。

本研究分析了不同竹种对分布范围内海拔梯度垂直变化的形态适应机制，即以叶长、叶宽和叶长宽比等表型特征的显著改变及叶片厚度、维管束长宽度、乳突数量等结构特征的显著变化来适应环境的显著变化。本研究结果对研究竹类的生态适应性和分布具有重要的科学意义和现实价值。