复方红豆杉胶囊对人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型抗肿瘤活性及其作用机制的研究*

钟 慧 刘利英 任晓红 党 洁 渠淑云 周卫东

（1.陕西省核工业215医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西省榆林市第一医院，陕西 榆林 718000）

卵巢癌是女性生殖器癌症中病死率较高的恶性肿瘤之一，尽管目前患者的治疗效果及生存率有所提高，但由于卵巢癌具有易转移复发、耐药性较强等特点，患者的预后仍不乐观，5年生存率不足40%[1-2]。因此，探索出一种有效的肿瘤药物治疗方法，提高卵巢癌的抗肿瘤效果，已成为目前研究的热点。复方红豆杉胶囊是临床常用的抗肿瘤中药制剂，具有祛邪散结等功效，主要用于中晚期肺癌化疗的辅助治疗[3]。尽管有少数研究结果显示复方红豆杉胶囊中主要成分红豆杉水提取物对卵巢癌细胞具有较好的抑制作用，但体内实验却尚未开展，而该药物用于卵巢癌临床治疗的相关研究则更是鲜有报道[4]。为此，笔者对复方红豆杉胶囊用于人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型的抗肿瘤作用进行了研究，并对其主要机制进行了探讨，期望为卵巢癌的治疗及该药物的新型临床使用提供思路与方法。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

CN-1r型多管架高速自动离心机 （美国安捷伦公司）；NM-09型显微照相系统、Image-proplus 6.0图像分析系统及Quantity-One软件 （日本奥林匹斯公司）；TB-718型生物组织包埋机（武汉安达科技实业有限公司）；HM325型石蜡切片机 （德国米克公司）；Trans-Blot Turbo全能型半干式免疫蛋白转印系统（德国安义生物科技有限公司）。

1.2 药物及试剂

复方红豆杉胶囊（重庆赛诺制药有限公司，批号：2016010291）；阳性药环磷酰胺片（通化茂祥制药有限公司，批号：2017012309）；羧甲基纤维素钠（美国SIGMA 公司，批号：91092317）；β-actin（武汉博士德生物技术有限公司，批号：2017031209）；一抗 C型-半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（C-caspase-3）抗体、多重肿瘤抑制因子（MTS）抗体、B淋巴细胞瘤-2（BCL-2）抗体及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4）抗体（美国SIGMA 公司；批号依次为：11646811、11664671、11463467 及 11574578）， 二 抗 C-caspase-3、MTS、BCL-2及CDK4抗体 （美国SIGMA公司；批号依次为：19803461、18928745、 19804826 及 10987467），微量BCA蛋白定量试剂盒 （武汉博士德生物科技有限公司，批号：2015112109）。

1.3 实验细胞与动物

1.3.1 实验细胞 人卵巢癌SKOV3细胞购自陕西省疾病控制中心，批号：201610-2，将SKOV3细胞置于含100 U/mL青霉素、10%胎牛血清及100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在5%CO2、37℃及饱和湿度的培养箱中培养至对数生长期，采用生理盐水冲洗，并制备单细胞悬液，将细胞密度调整至1×107/mL备用。

1.3.2 实验动物 40只清洁级BALB/cA-nude雌性裸小鼠购自陕西省疾病控制中心，动物使用许可证号：SCXK（陕）2016-0892，鼠龄 6～8 周，体质量 18～22 g。所有小鼠饲养条件为昼夜各半，食物饮水不限制，室温，55%湿度。

1.4 分组与造模[5]

各组小鼠适应性喂养1周后随机分为模型对照组、环磷酰胺组、复方红豆杉胶囊低剂量组及复方红豆杉胶囊高剂量组，每组10只。将细胞密度为1×107/mL的SKVO3细胞悬液接种于裸小鼠胸壁皮下，细胞悬液接种量为0.2 mL，待肿瘤生长至100～250 mm3时即为建模成功。

1.5 给药方法

根据复方红豆杉胶囊及环磷酰胺的人体治疗剂量，并结合文献[6]中人体与动物的剂量转换公式来确定本研究中小鼠的治疗剂量。小鼠给药剂量（mg/kg）=12.3×成人剂量（mg/kg），成人体质量以 60 kg 计，复方红豆杉胶囊及环磷酰胺的人体一般剂量分别为1.8 g/d和 0.15 g/d， 换算成小鼠剂量分别为 0.369 g/（kg·d）和0.031 g/（kg·d），选取复方红豆杉胶囊的一般给药剂量为红豆杉低剂量组 [0.369 g/（kg·d）]，2 倍一般给药剂量为红豆杉高剂量组[0.74 g/（kg·d）]。 将未成功建模或死亡的小鼠剔除后，对剩余小鼠进行给药，红豆杉低、高剂量组小鼠分别给予0.369、0.74 g/kg的复方红豆杉胶囊灌胃，而其余组则予等量生理盐水灌胃，连续给药14 d。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 一般情况 末次给药24 h后，采用脱颈法将小鼠处死，取其皮下肿瘤组织，检测小鼠肿瘤组织长短径及瘤体质量，计算肿瘤体积与肿瘤抑制率，其中肿瘤抑制率=（模型对照组肿瘤体积－给药组肿瘤体积）/模型对照组肿瘤体积×100%；肿瘤体积=[（长径×短径2）/2（mm3）]。

1.6.2 肿瘤组织病理切片 将上述小鼠的肿瘤组织平均分为6部分，取其中一部分，采用4%多聚甲醛液固定，依次经过石蜡包埋、苏木素/伊红（HE）染色、连续切片、烤片与封片处理后观察其病理组织学变化。

1.6.3 采用免疫荧光染色方法检测肿瘤组织中C-caspase-3、MTS、BCL-2及CDK4表达量 取4份上述肿瘤组织样本，根据试剂盒说明书中免疫荧光染色方法对 C-caspase-3、MTS、BCL-2及 CDK4的表达量进行检测：采用石蜡切片脱蜡、水化、抗原修复、一抗结合、二抗结合、复染及封片，并将封好的切片置于荧光显微镜中，对其进行拍照，采用Image-proplus 6.0图像分析软件统计小鼠肿瘤组织中的阳性信号数。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 复方红豆杉胶囊对卵巢癌小鼠肿瘤病灶一般情况的影响

见表1。造模过程中，模型对照组及环磷酰胺组均成功造模且无小鼠死亡，而红豆杉高剂量组及低剂量组均出现1只小鼠造模失败但无小鼠死亡。与模型对照组比较，环磷酰胺组、红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组肿瘤体积与肿瘤质量均显著降低（P＜0.05）。与环磷酰胺组比较，模型对照组、红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组肿瘤体积与肿瘤质量均显著增高，而红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组肿瘤生长抑制率均显著降低（P＜0.05）。

表1 各组小鼠肿瘤病灶一般情况比较（±s）

表1 各组小鼠肿瘤病灶一般情况比较（±s）

与模型对照组比较，*P＜0.05；与环磷酰胺组比较，△P＜0.05。下同。

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2.2 复方红豆杉胶囊对卵巢癌小鼠肿瘤病灶病理学检查的影响

见图1。HE染色结果显示，模型对照组肿瘤病灶中癌细胞形态与染色均正常，结构完整且大小均匀。环磷酰胺组肿瘤病灶中癌细胞出现大面积凋亡及坏死，而红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组小鼠肿瘤病灶中癌细胞亦出现坏死，但坏死程度均不及环磷酰胺组。

2.3 荧光免疫组化法检测小鼠 C-caspase-3、MTS、Bcl-2及CDK4的表达情况

图1 小鼠肿瘤组织病理学检查结果（HE染色，200倍）

见表2。荧光免疫组化染色中，C-caspase-3、MTS、Bcl-2及CDK4阳性均呈现橙红色分布于肿瘤细胞中，且呈弥漫性或颗粒状分布。荧光免疫组化结果表明，模型对照组小鼠肿瘤病灶中Bcl-2及CDK4均呈弱阳性或无明显表达，而C-caspase-3及MTS均呈强阳性；环磷酰胺组、红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组小鼠肿瘤组织中Bcl-2及CDK4的阳性表达均呈弱阳性或无明显表达，而C-caspase-3及MTS的阳性表达均呈强阳性。见图2～图5。半定量分析结果表明，与模型对照组比较，环磷酰胺组、红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组Bcl-2及CDK4相对表达量均明显降低，而C-caspase-3及MTS相对表达量均明显增高 （P＜0.05）。与环磷酰胺组比较，模型对照组、红豆杉高剂量组及红豆杉低剂量组Bcl-2及CDK4相对表达量均明显增高，而C-caspase-3及MTS相对表达量均明显降低（P＜0.05）。

表 2 各组小鼠 Bcl-2、CDK4、C-caspase-3及 MTS荧光免疫组化相对表达量比较（±s）

表 2 各组小鼠 Bcl-2、CDK4、C-caspase-3及 MTS荧光免疫组化相对表达量比较（±s）

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图2 小鼠肿瘤组织中Bcl-2的表达情况（荧光免疫组化染色，400倍）

图3 小鼠肿瘤组织中CDK4的表达情况（荧光免疫组化染色，400倍）

图4 小鼠肿瘤组织中C-caspase-3的表达情况（荧光免疫组化染色，400倍）

图5 小鼠肿瘤组织中MTS的表达情况（荧光免疫组化染色，400倍）

3 讨 论

卵巢癌是临床常见的女性生殖系统恶性肿瘤，手术及化疗是该疾病的主要治疗方法，尽管上述治疗手段均较为成熟可靠，但部分老年患者及晚期患者无法耐受手术治疗，化疗则存在着全身药物不良反应较大、易出现耐药性等缺点，而中药因其具有全身毒副作用小、疗效确切及多靶点调控等优点在临床中备受重视[7-8]。复方红豆杉胶囊主要由红豆杉、红参及甘草等中药材所组成，具有活血祛瘀、消肿散结等功效，临床常用于肺癌等多种恶性肿瘤的辅助治疗[9]。现代药学研究结果表明，该药物中主要成分红豆杉水提取物具有较好的抗肿瘤活性，在体外对于乳腺癌细胞等恶性肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制活性[10]。尽管复方红豆杉胶囊的抗癌效果已被临床普遍认可，但将其用于乳腺癌治疗的研究却基本未见开展，鉴于该药物具有较好的抗乳腺癌物质基础，笔者采用人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型，探讨了复方红豆杉胶囊对卵巢癌的抗肿瘤效果，并对其作用机制进行了阐述，期望为该药物的新应用提供依据。

细胞凋亡指的是由基因编码所调控的细胞主动自杀，又被称为程序性细胞死亡，该过程既是消除机体异常增殖细胞的理想途径，也是生物体维持自身稳定的一个重要机制，恶性肿瘤细胞的增殖与凋亡的失衡在癌症的发展过程中起到至关重要的作用[11]。研究结果表明，C-caspase-3是机体中重要的促进细胞凋亡因子，在蛋白酶级联切割作用中处于核心位置，该蛋白被激活会造成肿瘤细胞大量死亡[12]。Bcl-2能够提高细胞中线粒体膜电位水平，抑制C-caspase-3蛋白的表达与活化，从而阻滞C-caspase-3的促癌细胞凋亡作用[13]。MTS可有效调节细胞周期G1期的发展进程，并可对CDK4的表达起到负调节作用，从而促进癌细胞的凋亡[14]。CDK4则可造成肿瘤细胞凋亡异常，导致细胞平衡紊乱而引起癌细胞呈恶性生长趋势[15]。由此可见，C-caspase-3、MTS、Bcl-2 及 CDK4 均是有效反映卵巢癌细胞凋亡的关键蛋白，对于探讨药物对卵巢癌的治疗效果及其作用机制具有重要意义。

在本研究中，高剂量及红豆杉低剂量组小鼠病灶体积及肿瘤质量均显著低于模型对照组，且病理学观察结果显示肿瘤组织中均可见不同程度的癌细胞凋亡，提示复方红豆杉胶囊可有效抑制卵巢癌肿瘤组织的增长。进一步研究结果显示，红豆杉高剂量组及低剂量组小鼠肿瘤组织中Bcl-2及CDK4相对表达量均明显低于模型对照组，而C-caspase-3及MTS相对表达量均明显高于模型对照组，提示复方红豆杉胶囊具有较好的促肿瘤细胞凋亡活性，该作用可能是其具有较好抗肿瘤活性的主要机制之一。

综上所述，复方红豆杉胶囊对人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型具有良好的治疗作用，且其主要机制可能与该药物促进肿瘤细胞凋亡有关，值得进行深入研究。然而本研究中仍存在药物具体机制探讨不清等问题，后期还需进一步完善。此外，由于小鼠与人体的实际情况存在着一定的差别，故本研究的实验结论是否适用于临床还需要进行深入的验证。