结球菊苣叶总黄酮提取工艺研究

刘馨瑶， 李金秒， 张利萍， 张万忠

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

结球菊苣(knot ball chicory)又称为红菊苣，菊科，属多年生草本植物，是一种叶菜，是海水蔬菜的一种，起源于地中海沿岸中亚和北非，欧美国家普遍种植，特雷维索红菊苣和维罗纳红菊苣享有巨大的好评,当地每年生产250 000 t[1].菊苣含有大量的天然化学成分，如菊糖、有机酸类、生物碱类、香豆素类、三萜类、倍半萜内酯类等，现已确定的化合物有乙酸降香萜烯醇脂、α-香树脂醇、蒲公英萜酮、胡萝卜苷、山莴苣苦素、菊粉、高果糖浆、低果聚糖等[2].人类早在古代就开始使用菊苣，主要是利用它的药用价值，即健胃消食，也可用于解荤腻，还有清肝利胆的功效.结球菊苣同样具有抗氧化活性,结球菊苣中水溶性黄酮类化合物存在着特殊效用,流行病学研究描述了许多类黄酮对预防癌症、心血管疾病和衰老的有益影响[3].结球菊苣提取物具有许多的生理活性,比如抗炎作用、增强免疫能力、降低血糖和胆固醇等[4-5].菊苣根可增进消化器官的活动机能，增强食欲；高浓度根制剂可增强胃分泌，却不增进平滑肌张力[6].随着人们生活水平的不断提高，人们对绿色食品市场需求也不断增加，而菊苣由于味道有些苦，从而减少了虫害，避免了大量使用农药，其可以作为蔬菜食用[7-8].

目前，对黄酮类物质的提取研究在国内外已经成为一个热点，黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的多酚类化合物，常连接甲基、甲氧基、异戊烯基、酚羟基等官能团,可与糖结合生成苷[9-10].植物中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮普遍应用于医药、食品和化工等领域中[10-11].结球菊苣中含有丰富的黄酮、皂苷、多糖和三萜类化合物，本实验以结球菊苣叶为原料，探讨乙醇加热回流提取法提取结球菊苣叶中总黄酮的工艺，从而为结球菊苣的综合利用提供参考.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

结球菊苣，海城市三星生态农业有限公司；芦丁对照品，索莱宝公司；无水乙醇、体积分数95 %乙醇、亚硝酸钠试剂、硝酸铝试剂、氢氧化钠试剂均为分析纯.

FA1104电子天平，沈阳杰龙仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；RE-6000旋转蒸发仪，上海亚荣生物仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器责任公司；WFZ-UV 2000紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理

将结球菊苣叶风吹除尘，真空干燥，粉碎研磨，过40目筛，得结球菊苣粉末，留存备用.

1.2.2 标准曲线的绘制

参照药典[12]所记载测定绘制标准曲线，精密称取芦丁对照品3.2 mg放置于100 mL容量瓶中，加入体积分数为70 %的乙醇至刻度，混合均匀，制成质量浓度为0.032 g/L的标准品溶液，依次精密称取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mL标准品溶液，分别置于试管中，各加入质量分数为5 %的亚硝酸钠0.6 mL，摇匀，静置6 min，各加入质量分数为10 %的硝酸铝0.6 mL，摇匀，静置6 min，再各加入质量分数为4 %的氢氧化钠4 mL，摇匀，静置15 min，以第一瓶作为空白对照，在510 nm处测其紫外吸光度，依次记录数据，并绘制以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标的标准曲线.

1.2.3 总黄酮提取工艺流程

结球菊苣粉末→加热回流提取→过滤→提取液浓缩→干燥→菊苣总黄酮含量测定.

1.2.4 总黄酮提取的单因素试验

以总黄酮的提取率为分析指标，分别研究比较不同的乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比(质量体积比，以下同)对结球菊苣总黄酮提取率的影响.

1.2.5 总黄酮提取的正交试验

根据单因素试验结果，将乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、料液比(D)作为试验因素进行正交设计，因素水平表见表1.

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors level table

1.2.6 验证实验

称取结球菊苣粉末10 g，平行3份，在1.2.5所得最佳提取工艺条件下提取结球菊苣中的总黄酮，计算提取率.

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以吸光度(y)为纵坐标，芦丁质量浓度(x)为横坐标画出标准曲线，结果见图1.对不同质量浓度的芦丁标准品溶液，由小到大，分别测吸光度.线性回归得到吸光度与质量浓度关系式：

y=1.249 0x-0.006 9，R2=0.999 5.

图1 标准芦丁曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2 总黄酮提取率的单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

准确称量5份结球菊苣叶粉末，以1∶20的料液比例，依次加入体积分数为30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇，80 ℃恒温水浴回流2 h，趁热过滤，浓缩，测吸光度，计算黄酮含量，得乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响，结果见图2.

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.2 The influence of ethanol concentration of flavonoids extraction yield

由图2可知：乙醇体积分数在70 %以后开始波动，在70 %处出现最大值，当乙醇体积分数偏低或偏高时，黄酮提取率均有所降低.这是由于中等体积分数的乙醇水溶液的极性同结球菊苣中黄酮的极性相近，故黄酮可以更好地溶解析出；低体积分数的乙醇水溶液的极性会比较大，故杂质比较容易溶解，杂质含量升高，所得的黄酮提取率就较低[13]；体积分数大的乙醇水溶液吸水性强，极性小，改变了细胞的溶胀，故而黄酮提取率降低[14].

2.2.2 提取时间对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数为70 %、提取温度80 ℃、料液比1∶20条件下，提取时间分别为1、2、3、4、5 h，研究提取时间对总黄酮提取率的影响，结果见图3.

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.3 The influence of extraction time on flavonoids extraction yield

由图3可知：提取时间4 h效果最好；开始时随着时间的延长，黄酮类物质溶解的越来越多，提取率升高；后来随着时间过长，提取率反而下降.这可能是由于提取过程中，时间的增加会引起乙醇挥发；此外，长时间的水浴加热也可能改变结球菊苣叶中黄酮类化合物的活性成分结构，从而稳定性降低，影响提取率[15].

2.2.3 提取温度对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70 %、料液比1∶20、水浴回流4 h的条件下，研究提取温度对总黄酮提取率的影响，结果见图4.由图4可知：在60、70、80 ℃时，温度对提取率的影响达到峰值，且基本稳定.这主要是因为温度升高溶解度增大，温度再升高，提取率反而降低.

图4 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 The influence of extraction temperature on flavonoids extraction yield

2.2.4 料液比对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70 %、提取温度70 ℃、恒温水浴回流4 h的条件下，研究料液比对总黄酮提取率的影响，结果见图5.由图5可知：当料液比为1∶40时提取率最高，提取效果最好.

图5 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.5 The influence of material liquid ratio on flavonoids extraction yield

2.3 正交试验结果

按照表1进行正交试验，试验结果见表2.

由表2可知：乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比4个因素对结球菊苣叶总黄酮提取率的影响顺序为提取温度(C)>料液比(D)>乙醇体积分数(A)>提取时间(B).方差分析结果见表3，由表3可知：提取温度(C)对黄酮提取率有显著影响，而乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、料液比(D)对提取率影响不大.最优水平搭配为A1B3C1D3，即料液比1∶45，乙醇体积分数60 %，60 ℃加热回流提取4 h.

表2 正交试验设计及结果Table 2 The orthogonal experiment design and result

表3 总黄酮提取率方差分析Table 3 Flavonoids extraction yield anova table

2.4 优化工艺验证实验

取3份结球菊苣粉末，每份10 g，按上述最优提取工艺条件进行验证实验，测得平均总黄酮提取率为4.11 %.

3 结 论

以结球菊苣总黄酮的提取率为考察分析指标，采用乙醇加热回流法提取结球菊苣中的总黄酮，通过对乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比进行单因素试验和正交试验，优选出结球菊苣总黄酮提取的最佳工艺条件，即乙醇体积分数为60 %、提取时间4 h、提取温度60 ℃、料液比1∶45.在所选最佳工艺条件下，进行验证实验，平均提取率为4.11 %.