孕烯醇酮肟衍生物的合成与体外抗癌活性

刘跃金, 赵博文, 于春影

(1.沈阳化工大学 制药与生物工程学院, 辽宁 沈阳 110142;2.江苏豪森药业股份有限公司, 江苏 连云港 224200)

1997年刘跃金等对羟基胆烷酸类及羟基胆甾烷类化合物进行了小鼠L1210白血病细胞体外增值抑制实验,表明胆甾-3β,5α,6β-三醇L5(见图1)和3β,5α,6β-三羟基胆-24-酸甲酯具有较好的抗癌活性,且A/B环的3β,5α,6β-三醇结构是有效结构,17β-侧链对活性亦有重要影响[1-2].2001年Ana R等从柳珊瑚plexaurellagrisea中分离出化合物胆甾-3β,5α,6β,7β-四醇,它对A549人肺癌细胞和HT-29人结肠癌细胞有较好的抗癌活性,ED50皆为1 μg·mL-1[3].2002年林永成等从海洋真菌2059(保藏号CCTCCM202030)提取出化合物麦角甾-8(9),22(Z)-二烯-3β,5α,6β,7α-四醇,它对BEL-7402人肝癌细胞和NCI4460人大细胞肺癌细胞的IC50值分别为8.45和5.03 mg/L[4].刘跃金等于2004年[5]和2007年[6]对羟基胆烷酸类及羟基胆甾烷类化合物进行了进一步的抗癌活性研究,表明胆甾-3β,5α,6β-三醇和3β,5α,6β-三羟基胆-24-酸甲酯对小鼠肉瘤S180有较好的体内抗癌活性.上述报道进一步表明A/B环的3β,5α,6β-三醇结构是有效的部分.2008年Merlani M I等合成了3α-羟基孕甾-20-肟、雄甾-1,4-二烯-3,20-二肟等,它们对Hela子宫颈癌细胞显示出一定的抗癌活性[7].考虑肟结构对17β-侧链活性的可能影响,以孕烯醇酮为原料合成具有3β,5α,6β-三羟基的甾体母环,同时具有17β-肟侧链的化合物,以进一步考察其对抗癌活性的影响.

图1 胆甾-3β,5α,6β-三醇结构Fig.1 The structure of cholesta-3β,5α,6β-triol

1 合成路线

以孕烯醇酮L0为原料,在质量分数为88 %的甲酸中用质量分数为30 %的过氧化氢(H2O2)溶液氧化,质量分数为3 %氢氧化钠甲醇(methanol)溶液中水解得3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-酮L1.再分别以L0和L1在乙醇(ethanol)中与盐酸羟胺经亲核加成、消除反应生成3β-羟基孕甾-5-烯-20-肟L3和3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-肟L2.L1在乙酸(acetic acid)中经乙酐(acetic anhydride,(Ac)2O)酰化得3β,6β-二乙酰氧基-5α-羟基孕甾-20-酮,合成路线见图2.

图2 孕烯醇酮肟衍生物等的合成路线Fig.2 Synthetic routes of derivatives of pregnenolone-oxime and so on

2 实验与结果

2.1 原料与仪器

孕烯醇酮,质量分数≥98 %,成都科恩医药化工实业有限公司;BEL-7402人肝癌细胞株,中国科学院上海生科院细胞资源中心;RPMI1640培养基,美国Gibco公司;杭州四季青小牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;胆甾-3β,5α,6β-三醇L5,自制[1];其他试剂,分析纯,天津市博迪化工有限公司.

细胞增殖用二氧化碳培养箱，型号INCO2-108，德国MEMMERT；红外光谱用红外分光光度计，型号IFS-55，瑞士Bruker；核磁共振氢谱用核磁共振仪，型号ARX-300B，瑞士Bruker;细胞光密度测定用酶标仪，型号DNM-9602G，北京普郎.

2.2 3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-酮的合成

将孕烯醇酮5.0 g(15.8 mmol)加入到120 mL质量分数为88 %的甲酸中,沸水浴10 min,冷却至室温,加质量分数为30 %过氧化氢15 mL,28 ℃搅拌6 h.减压蒸出水和甲酸,向反应物中加入质量分数为3 %氢氧化钠甲醇溶液100 mL,回流搅拌4 h,过滤,再将滤液减压浓缩析出结晶,得浅黄色固体7.5 g,以氯仿-甲醇(体积比15∶1)为洗脱剂,硅胶柱层析,得白色固体1.2 g,收率21.7 %,mp257～259 ℃.IR(cm-1)(KBr压片):3 419(O—H),2 936(C—H),1 694(C==O).

2.3 3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-肟的合成

将3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-酮100 mg(0.285 mmol),加无水乙醇搅拌至完全溶解,加入盐酸羟胺30.7 mg、无水乙醇钠36.2 mg,搅拌至完全溶解,置于65 ℃加热回流8 h,反应完毕后,蒸出反应溶剂,得淡黄色固体90 mg.以氯仿-甲醇(体积比12∶1)为洗脱剂,硅胶柱层析,得白色固体45.2 mg,收率43.3 %,mp 198.5～200.5 ℃(文献值[8]198～200 ℃).IR(cm-1)(KBr压片):3 460(O—H),2 931(C—H),2 871(C—H).1HNMR(DMSO-d6)δ：10.32(1H,s,N-OH),4.43(1H,d,3β-OH),4.19(1H,d,6β-OH),3.83(1H,m,3α-H),3.68(1H,s,5α-OH),1.72(3H,s,21-CH3),1.02(3H,s,19-CH3),0.53(1H,s,18-CH3).

2.4 3β-羟基孕甾-5-烯-20-肟的合成

将孕烯醇酮100 mg(0.316 mmol)加无水乙醇搅拌至完全溶解,加盐酸羟胺22 mg、无水乙酸钠26 mg,搅拌至完全溶解,加热回流7 h;加入大量冰水,室温搅拌约1 h,析出大量白色固体,过滤,干燥,得白色固体91.5 mg.以氯仿-甲醇(体积比60∶1)为洗脱剂,硅胶柱层析,得白色固体74.7 mg,收率71.4 %,mp 217.0～219.0 ℃.IR(cm-1)(KBr压片):3 464(O—H),2 938(C—H),2 851(C—H).1HNMR(DMSO-d6)δ∶10.36(1H,s,N-OH),5.28(1H,t,6-H),4.62(1H,d,3β-OH),3.30(1H,m,3α-H),1.73(3H,s,21-CH3),0.98(3H,s,19-CH3),0.59(1H,s,18-CH3).

2.5 3β,6β-二乙酰氧基-5α-羟基孕甾-20-酮的合成

将3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-酮1.0g(2.3 mmol)加入到10 mL冰乙酸与5 mL乙酸酐组成的混合溶液中,沸水浴4 h,冷却至室温,加水稀释后析出白色晶体,过滤,干燥得白色固体0.85 mg,收率66.4 %,mp 214～216 ℃.IR(cm-1)(KBr压片):3 433(H—O),2 944(C—H),1 736(C==O),1 688(C==O).

2.6 BEL-7402人肝癌细胞MTT活细胞染色法体外增殖抑制实验

处于对数增长期BEL-7402人肝癌细胞经质量分数约为25 %的胰酶消化后,用RPMI1640培养液稀释,调整细胞密度为1×106个悬浮细胞/mL,每孔100 μL接种于96孔培养板各孔内,置37 ℃、体积分数为5 % 的CO2培养箱内,培养24 h.待细胞贴壁后,弃培养液,PBS(-)洗两次.精确称取样品,用二甲基亚砜(DMSO)助溶后加PBS(-)稀释,每组12孔,每孔加入的终质量浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1,培养24 h.终止前4 h每孔加5 g/L MTT 20 μL,继续培养4 h.弃培养液,各孔加入DMSO 150 μL,室温振荡15 min.用DNM-9602G酶标仪在570 nm测定各孔吸光度.各测试孔均值与对照孔均值比较,计算出各个样品的直线回归方程,求出其半数抑制质量浓度(IC50)值.IC=(1-给药组细胞数/对照组细胞数)×100 %,结果见表1.

表1 目标化合物对BEL-7402肝癌细胞的体外IC50Table 1 IC50 of target compounds on BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line in vitro

3 讨论与结论

3β-羟基孕甾-5-烯-20-肟、3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-肟和3β,6β-二乙酰氧基-5α-羟基孕甾-20-酮经IR和1HNMR确证了结构正确.

BEL-7402人肝癌细胞体外增殖抑制实验表明:胆甾-3β,5α,6β-三醇L5的抗癌活性明显好于3β-羟基孕甾-5-烯-20-肟L3、3β,5α,6β-三羟基孕甾-20-肟L2和3β,6β-二乙酰氧基-5α-羟基孕甾-20-酮L4.也进一步说明甾体母核的3β,5α,6β-三醇的3,6-乙酰化后,疏水性增强,不利于抗癌活性;而17β-侧链的亲水性增强,同样不利于抗癌活性,侧链缩短也可能是活性减弱的一个因素,这和文献[1-2,5]报道基本一致.