一种镍(Ⅱ)刚性特征氮配位聚合物的结构及其细胞毒性研究

贾志丽, 齐真真, 高恩军

(沈阳化工大学 应用化学学院 辽宁省无机分子基化学重点实验室, 辽宁 沈阳 110142)

合成药物与生命大分子的靶类作用机制是药物活性评价的手段[1].一般认为 DNA 是药物的主要靶点.由于 DNA 是一种重要的细胞受体,合成药物切割 DNA 和调节细胞凋亡在致癌和癌症治疗中都起着重要作用[2-3].过渡金属配合物可以调节对 DNA 结合和切割能力,Ni(Ⅱ)配合物已经被提出用作潜在的抗癌和抑癌剂[4].在癌症治疗领域,顺铂及其衍生物是使用最广泛的金属基药物.但是有一些缺点,如一般毒性,非特异性靶向和获得性耐药.在新兴的研究领域,结构的合成方面,如高功能的金属药物引起了人们极大的关注.本文合成了 Ni(Ⅱ)与刚性氮配位,配体 1,4-bis(1-imidazoly)benzene(1,4-二咪唑基苯,用 L示之)和 CO2协同配位的混合聚合物,即[Ni(L)2(CO2)]n.应用光谱技术、电泳技术、细胞凋亡手段等研究了聚合物与 DNA 的作用机制和对肿瘤细胞抑制效果,并得出有价值的科学信息.

1 实验部分

1.1 实验选材

所有试剂均为A.R级. pBR322质粒DNA和FS-DNA(鱼精DNA)购自北京华美生物技术有限公司.HeLa细胞经细胞瘤珠储存和CO2细胞培养达到测定状态.元素分析(C,H和N)使用Finnigan EA 1112仪器.Perkin-Elmer LS55荧光分光光度计上测量荧光值.SOPTOP XD-RFL荧光显微镜进行成像研究.

1.2 配合物的合成

准确称取硝酸镍(0.072 g)和1,4-二咪唑基苯(0.025 g)放入装有12 mL[V(DMF)∶V(H2O)=1∶2]溶剂的聚四氟乙烯反应釜中,用0.05 mol/L HNO3调节pH值为5.6,室温条件下反应2 h,空气中的二氧化碳被氧化.置入呈梯度升温的150 ℃的烘箱中,恒温加热72 h后取出,自然冷却至室温.形成淡绿色晶体颗粒.收率:59.8 %.元素分析[理论值(实测值),w/%]:C,37.00(37.01);H,4.18(4.17);N,12.33(12.31).

2 结构分析

通过单晶X-射线衍射扫描,得出该配位聚合物在空间呈八面体结构,如图1所示.晶体结构中主要的键长(λ/nm)如下:Ni(1)—O(1):2.068;Ni(1)—O(2):4.154;Ni(1)—N(1):2.122;Ni(1)—N(3):2.127;主要的键角[θ/(°)] 如下:O(1)—Ni(1)—N(3)#3:87.251;O(1)#3—Ni(1)—N(1)#3:92.75;O(1)—Ni(1)—N(3):89.57;N(1)#3—Ni(1)—N(3):92.58;N(1)#3—Ni(1)—N(3)#3:87.42;O(1)—Ni(1)—N(3)#3:90.43.图2是配位原子之间通过配位键相互协调所得一维链状结构图.图3是配位聚合物的π-π相互作用结构图.

图1 配位聚合物配位结构Fig.1 Coordination polymer monomer structure

图2 配位聚合物一维链状结构Fig.2 Coordination polymer one-dimensional chain structure

图3 配位聚合物二维网状结构Fig.3 Coordinationpolymer two-dimensional network structure

3 细胞毒性研究

3.1 荧光光谱

溴化乙锭(EtBr)是一种常用的 DNA 荧光探针,是共轭芳香环的平面分子,这种共轭分子可以平行地嵌入 DNA 双链的配位碱基对之间,形成堆积.EtBr本身有微弱的荧光,而 DNA分子没有荧光,当 EtBr 插入 DNA 分子之后,EtBr 分子可以平行地固定在 DNA 分子内部,从而使其分子平面刚性增加,碰撞猝灭减小,荧光显著增强[5-6]. 在 DNA/EtBr 复合物中,EtBr 发出的荧光比游离 EtBr 发射的荧光强度大10倍[6].当 EtBr 从双螺旋中游离出来或双螺旋结构减少时,荧光会明显下降,所以当有其他分子也能嵌入 DNA 碱基对之间时,将会与 EtBr 竞争 DNA,EtBr 将被从 DNA / EtBr复合物中挤出,而 DNA/EtBr 体系的荧光产生猝灭.因此,EtBr 可作为 DNA 结构的荧光探针[7-9]. 根据经典斯特恩方程[8-9]:I0/I= 1 +Ksqr,其中:I,I0分别代表存在和不存在配位聚合物时的荧光强度；Ksq表示斯特恩猝灭常数,定性描述配位聚合物与 DNA 的作用强弱；r代表配位聚合物与 DNA 的浓度比[9].从图 4 可以看出配位聚合物对 DNA/EtBr 系统产生了影响.以526 nm 作为激发波长,DNA/EtBr 复合物的荧光发射峰处于 613 nm 处.随着配合物浓度的增加荧光强度逐渐减弱同时伴随不同程度的荧光猝灭,此现象表明配合物与DNA发生插入作用.从图5可以看出配合物的猝灭常数Ksq=0.254,说明配合物与DNA发生了插入作用.

(聚合物)=0 mol·L-1 2.c(聚合物)=0.5×10-6 mol·L-1 3.c(聚合物)=1.0×10-6 mol·L-1 4.c(聚合物)=1.5×10-6 mol·L-1 5.c(聚合物)=2.0×10-6 mol·L-1 6.c(聚合物)=2.5×10-6 mol·L-1 7.c(聚合物)=3.0×10-6 mol·L-1 8.c(聚合物)=3.5×10-6 mol·L-1

图5 配位聚合物的猝灭常数Fig.5 Quenching constant of coordination polymer

3.2 凝胶电泳

带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳[6].以琼脂糖为介质的凝胶电泳是测定金属配合物对 DNA 发生切割或嵌入、解旋作用的重要实验方法.通过电泳进行环状质粒 DNA 切割时,超螺旋形式(Form Ⅰ)将观察到最快的迁移.如果一条链断裂,则超螺旋带将产生较慢移动的带切口的圆形(Form Ⅱ).如果两条链都裂开,将会产生一个线性形式(Form Ⅲ),它们在两者之间迁移.图 6 是配位聚合物对 pBR322 质粒 DNA切割效果图.对于没有金属配合物的对照,观察到少量 DNA 切割(泳道 0).当复合物在1.25 μmol/L 浓度下可以诱导质粒 DNA 明显的裂解,随着复合物浓度的增加(泳道 1～3),pBR322 DNA 的 Form Ⅰ 的量逐渐减少,而 Form Ⅱ 逐渐增加,说明配位聚合物对质粒DNA具有一定的切割作用与荧光效果相一致.

图6 配位聚合物切割质粒pBR322 DNA效果图Fig.6 Coordination polymer cutting plasmid pBR322 DNA renderings

3.3 配合物对HeLa细胞形态学凋亡研究

细胞凋亡是最常见的基因控制过程,在组织稳态和消除不需要的细胞中发挥重要作用,而不影响正常和未受影响的细胞凋亡[10].细胞凋亡又称细胞程序性死亡,是指细胞在一定的生理和病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程[11].细胞凋亡不同于细胞坏死,是程序性死亡过程的一种主要形式,强调的是形态学上的改变[12-14].为了观察配位聚合物对HeLa 的影响,将 HeLa 细胞在载玻片上生长至体积分数为70 %汇合.聚合物加入到培养基中,在 37 ℃下培养 12 h.用 Annexin V-FITC 和 PI 染色凋亡的和活的 HeLa 细胞,在荧光显微镜下观察图像,结果如图 7 所示.由图7可以看出，癌细胞明显发生改变.

图7 配位聚合物对HeLa细胞作用12 h后效果Fig.7 Effect of coordination polymer on HeLa cells for 12 h

4 结 论

(1) 用配体 1,4-bis(1-inidazoly)benzene(L 示之)与金属镍盐反应制得的配位聚合物[Ni(L)2(CO2)2]n呈八面体构型.4 个 1,4-bis(1-inidazoly)benzene 配体中咪唑环上的 N 原子和 CO2上的氧原子与中心原子 Ni 配位,该分子存在穿过 Ni(Ⅱ)的中心对称,形成规则的八面体结构.

(2) 通过荧光谱图和凝胶电泳可知配位聚合物[Ni(L)2(CO2)2]n与 DNA 之间以插入作用方式存在,同时对 DNA有切割作用.通过细胞形态学研究,配合物在一定程度上可以引起 HeLa癌细胞程序性死亡.