益肾蠲痹丸对CIA大鼠辅助性T细胞相关细胞因子的影响❋

展俊平，孟庆良，范 围，屈祥科，陈梦雪，王建明Δ

(1.河南中医药大学第二附属医院风湿病科，郑州 450002； 2. 中日友好医院中医风湿科，北京 100029)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节慢性炎症、非化脓性炎症等为主要表现的多系统、炎症性自身免疫性疾病[1]。现代医学研究证实，类风湿关节炎急性期以间质水肿和中性粒细胞浸润为主；慢性期滑膜下层出现结节，内含大量浸润的CD4+T淋巴细胞，又称辅助性T细胞(Th细胞)。Th细胞是细胞因子的主要来源，根据其分泌的细胞因子种类不同，可分为Th0、Th1、Th2及Th17等多种亚型，其中包括Th1细胞多分泌IFN-γ、IL-2等，Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，Th17细胞分泌IL-17。这些细胞因子相互联系构成“分子网络”，共同调节机体“免疫-神经-内分泌”的平衡，对RA的发生发展起关键调控作用。

“益肾蠲痹丸”是根据著名中医风湿病专家朱良春先生临床经验方开发的中成药。实验研究表明，该药对改善RA患者临床症状、预防关节骨膜破坏有肯定疗效，其相关药理机制的研究有待深入开展[2-3]。本实验以Th细胞相关细胞因子为切入点，以胶原诱导的类风湿关节炎大鼠模型(collagen induced arthritis, CIA)为实验材料，定量分析益肾蠲痹丸对Th细胞相关细胞因子的影响，为探究益肾蠲痹丸的药理机制提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂及耗材 益肾蠲痹丸，江苏正大清江药业有限公司提供(Z10890004)；弗氏不完全佐剂及牛II型胶原，购自Sigma-Aldrich公司 (MO, USA)；ProcartaPlexTM多因子免疫检测试剂盒购自莱兹生物(ebioscience，货号EPX060-20831-901)。IL-17酶联免疫试剂盒购自Bender 公司(USA)；常规实验室化学试剂购自北京化学试剂有限公司。

1.1.2 实验动物 SPF级SD大鼠60只(雌雄各半，7～8周龄)，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(动物合格证号SCXK(京)2005-0004)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠CIA模型制备 采用2次免疫法制备CIA大鼠模型。制备方法：在尾根部注射牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂乳化液200μg(1 mg/ml)，7 d后依照相同方法行第2次注射牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂乳化液100 μg[4]。对照组大鼠用相同方法注射生理盐水。

1.2.2 大鼠CIA模型评估 采用关节肿胀度测量方法。造模前在大鼠后肢踝关节上方0.5 cm处做出标记，用足趾容积测量仪测量其容积，计算其关节肿胀度。计算公式：肿胀度(edema rate)=(Vt-V0)/V0×100%(其中V0表示造模前的容积，Vt表示造模后的容积)。

1.2.3 动物分组及给药 首次免疫后18 d，依据关节肿胀度筛选出CIA模型复制成功的大鼠30只，按随机数字表法分成模型组(溶剂对照)、阳性药治疗组(甲氨喋呤，2.0 mg/kg.每周1次)和益肾蠲痹丸治疗组(4 g/kg·d)，每日1次，连续4周,正常对照组灌以等容积纯水。治疗结束后，各组大鼠经戊巴比妥钠麻醉，采用腹主动脉取血，2500 r/min，20 min离心后取血清分装后，-80℃冰冻备用。

表1 各组大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 A及IFN-γ水平检测结果

注： CIA模型组与正常对照组比较：**P<0.01；治疗组与CIA模型组比较:#P<0.05,##P<0.05

1.2.4 ProcartaPlexTM多因子免疫法检测血清细胞因子水平 依照试剂盒说明书的流程操作(该试剂盒包含IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 A的抗体磁珠)。取平底96孔板，加入上述抗体磁珠混合物；手持式磁性洗板器清洗磁珠，弃清洗液后加入25 μL标准品和待测样品，室温避光孵育2 h，手持式磁性洗板器洗培养板2次，每次30 min；加检测抗体混合物振荡孵育30 min；洗板后加链霉亲和素-PE(SAPE)振荡孵育30 min；洗板后上机检测(Luminex仪器读板)。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析t检验，P<0.05，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 关节肿胀度测量结果

图1显示，为对比药物疗效于治疗结束后测定各组大鼠关节肿胀度，结果表明与正常对照组比较，CIA大鼠关节肿胀度显著增高(P<0.01)；与CIA模型组比较，甲氨喋呤及益肾蠲痹丸治疗组大鼠关节肿胀度均有显著降低趋势(P<0.05)，且组间比较差异无统计学意义。

图1 治疗结束后各组大鼠关节肿胀度检测结果(n=10)注： CIA模型组与正常对照组比较：**P<0.01；治疗组与CIA模型组比较：#P<0.05

2.2 血清细胞因子水平检测结果

表1显示，多细胞因子检测结果表明，与正常组比较CIA大鼠血清IL-2、IL-6、IL-10及IL-17 A水平均呈显著增高趋势(P<0.01)，而IL-4及IFN-γ水平呈显著下降趋势(P<0.01)。与CIA模型组比较，益肾蠲痹丸治疗组大鼠血清IL-2、IL-6及IL-17 A水平呈显著降低趋势(P<0.05)，IL-10水平呈显著升高趋势(P<0.05)；而IL-4及IFN-γ水平变化不显著，组间比较差异无统计学意义。此外，益肾蠲痹丸治疗组与甲氨喋呤治疗组间比较，上述细胞因子水平变化比较差异无统计学意义。该结果初步表明，益肾蠲痹丸能下调CIA大鼠机体IL-2、IL-6、IL-17 A的表达，同时上调IL-10表达。

3 讨论

RA的病理特征主要是关节滑膜炎症，伴随滑膜细胞和血管异常增生，淋巴细胞、中性粒细胞及单核细胞向关节软骨及周围组织浸润，其关节病变呈慢性进行性、持续和反复发作的特点且致残率高[5-6]。近年来，由于慢作用抗风湿药的早期联合使用，以及生物制剂、激素、免疫抑制剂、生物制剂等新型药物不断出现，使RA的预后有了明显改善，多数RA患者的病情可得到理想的控制甚至完全缓解[7-8]。尽管如此，西医临床常用治疗方案尚存在很多不足，如明显副作用、耐药、价格昂贵等。为此，寻找并开发抗RA有效的天然药物成为研究者共同关注的命题。

RA属于中医痹症范畴，其病机与肝、肾亏虚及慢性劳损有关。益肾蠲痹丸的配方包含20余种中药材，具有标本兼顾、攻补并施、益肾壮督、蠲痹通络等功效，对改善类风湿关节炎患者临床症状、控制病情发展有显著的临床疗效。笔者所在课题组曾运用代谢组学技术探究益肾蠲痹丸干预性激素低下型CIA的作用机制。实验结果表明，益肾蠲痹丸可以显著抑制CIA大鼠前炎性因子(IL-1β、IL-6和IL-8)的水平[9]。本实验依托前期研究基础，重点观察了益肾蠲痹丸对Th细胞相关细胞因子的影响，期望探明该药抗炎及免疫调节的初步机制。结果表明益肾蠲痹丸能抑制机体促炎因子(IL-2、IL-6、IL-17 A)的合成和分泌，同时上调抗炎因子IL-10的表达。该结果提示，益肾蠲痹丸可在一定程度上平衡促炎细胞因子及抗炎细胞因子的平衡，其作用靶点可能与IL-2、IL-6、IL-17 A及IL-10有关，相应的基础研究有待进一步的开展。

细胞因子(Cytokine)是指一类由活化的免疫细胞和相关细胞产生的调节细胞功能的高活性、多功能、低分子蛋白质，它是除免疫球蛋白和补体以外的另一类可溶性免疫分子，多数由淋巴细胞和单核细胞分泌[10]。其中IL-2是活化的Th1细胞分泌的细胞因子，生物学功能很复杂，过量的IL-2可引起局部慢性炎症和基质破坏[11]。RA患者血清IL-2水平差异较大，多数学者认为其与不同病理时期、分型有关[12]。IL-6是一类多效应前炎性因子，在多种炎症性疾病中呈高表达，其生物活性包括介导炎症反应、参与免疫调节等[13]。IL-17是新发现的一类前炎性因子，主要由Th17细胞分泌，与机体多种炎性疾病有关。其不仅对组织炎症具有明显的促进作用，而且介导一系列炎症反应，直接参与RA关节软骨及骨膜组织破坏[14]。IL-10来源较复杂，Th2细胞及Treg细胞均可分泌。IL-10不仅能抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等前炎性因子的活性，而且可抑制Th1细胞及树突状细胞的增殖[15]。基于上述共识，益肾蠲痹丸治疗RA的药理机制可能与调节Th1、Th2、Th17等Th细胞亚型的生物学功能相关。

目前，细胞因子在RA发病中的作用已有大量的研究报道，但细胞因子之间的相互作用模式及生物学意义远未阐明，药物对细胞因子影响的作用途径及机制尚不清楚[16]。本实验尚局限于对益肾蠲痹丸影响Th相关细胞因子的现象观察，进一步的分子机制研究正在开展中，不久的将来我们将持续报道益肾蠲痹丸治疗RA分子药理机制的研究结果。