PCV-2d基因型的PCR-RFLP诊断方法的建立

郑庆礼, 吴昊宸, 黄瑞玲, 许文煌, 张誓育, 王全溪(福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002)

猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)被认为目前所发现的最小病毒[1].根据研究表明，PCV1并不导致猪群致病，而PCV2可以导致猪群发病[2].PCV2发现于20世纪90年代末，该病毒给养猪业造成巨大的损失[3].PCV2可引起猪的免疫抑制，可导致猪群发生断奶仔猪多系统衰弱综合征(postweaning multisystem wasting syndrome, PMWS)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)等[4].PCV2主要开放阅读框架有ORF1、ORF2和ORF3,其中ORF2编码的是主要的结构蛋白Cap蛋白,能使机体产生中和抗体[5].PCV2的基因型可分为PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d和PCV-2e等基因型[6].PCV-2b是国内流行的主要基因型，PCV2d仅次于PCV2b[5].在PCV的前期研究中，普遍认为PCV2b具有高致病性，而后研究表明，PCV-2a与PCV-2b的毒力并没有显著差异[7].根据Xiao et al报道，美国PCV-2d的流行程度从2012年的37.8%升高到2016年的72%，该研究结果表明，PCV-2d已代替PCV-2b成为流行株[8].PCV-2c目前仅在丹麦和巴西被发现，我国尚未发现PCV-2c型[9-10].PCV-2e基因型并不常见[11].

近年来，由于PCV2疫苗的使用，PCV2的流行得到有效控制.由于PCV2的基因型较多，经常出现免疫失败.有研究表明,PCV-2b的中和抗体可以中和PCV-2d病毒,但是不能完全清除猪体内的PCV-2d病毒[12].因此，有必要建立能够鉴别PCV-2d的诊断方法.本研究利用PCR-RFLP技术，建立了PCV-2d基因型的诊断方法，该研究结果对于临床快速诊断PCV-2d具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

本实验室保存的PCV-2d的克隆质粒.

1.2 仪器和试剂

主要仪器：Dl9700型PCR仪(北京东林生物技术公司)和DYY16D电泳仪(北京六一生物技术有限公司).

主要试剂：动物组织DNA提取试剂盒、Eeay Taq Mix、DL 2000 DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；DNA凝胶回收试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；MSPI酶[New England Biolabs (NEB)公司].

1.3 引物设计及酶切位点选择

根据NCBI上GenBank公布的PCV-2的基因序列，利用Oligo7设计引物，PCV-2扩增的引物序列，PCV-2-F：5′-CGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3′；PCV-2-R：5′-TTAGGGTTTAAGTGGGGGGT-3′，扩增产物702 bp；引物均由上海生物工程股份有限公司合成 .利用NEB在线软件对PCV2基因型进行酶切分析，发现PCV-2d含特有MSPI酶切位点，PCV-2d的酶切位点位于475 bp，可将PCV2d分为2个片段475和327 bp.

1.4 特异性试验

分别以猪瘟病毒(CFV)cDNA，伪狂犬病毒(PR) ，蓝耳病毒(PRRSV)cDNA，流行性腹泻(PEDV)cDNA的核酸为模板，用设计的引物及上述的条件进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照.

1.5 PCR反应体系的优化

1.5.1 退火温度的优化 PCR反应体系25 μL：模板2 μL，Eeay Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL.PCR反应条件：95 ℃变性 5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s，温度设置梯度分别为50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸8 min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照，筛选出最合适的退火温度.

1.5.2 模板量的优化 PCR反应体系25 μL,模板量设置梯度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL，Eeay Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O相应补足至25 μL.PCR反应条件：95 ℃变性5 min，95 ℃变性30 s，退火温度58 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸8 min.反应完成后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照，筛选出最合适的模板量.

1.5.3 循环数的优化 PCR反应体系25 μL,模板2 μL，Eeay Taq Mix 12.5μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL.PCR反应条件：95 ℃变性5 min，95 ℃变性30 s，退火58 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，循环数设置梯度，分别为25、30、35、40个循环，72 ℃延伸8 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照，筛选出最合适的循环数.

1.5.4 遗传进化树构建及同源性分析 将阳性样品的PCR产物送生工测序，并构建遗传进化树，进行同源性分析.

1.6 PCR产物的RFLP

取PCV-2d基因型的PCR产物，用MSPI限制性内切酶进行酶切.酶切体系(12.5 μL)：PCR产物8 μL，MSPI 1 μL,10*Cut Buffer 1.5 μL,ddH2O 8 μL.酶切时间为2 h.将酶切产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min， 凝胶成像系统观察反应结果并拍照.

1.7 PCR-RFLP的反应体系优化

1.7.1 PCR-RFLP体系酶量的条件优化 酶切体系(12.5 μL)，PCR产物8 μL，酶量设置梯度0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μL，10*Cut Buffer 1.5 μL，ddH2O相应补足至12.5 μL.PCV-2d进行酶切2 h.将酶切产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，Alpha凝胶成像系统观察反应结果并拍照.

1.7.2 PCR-RFLP体系酶切时间的条件优化 酶切体系(12.5 μL)：PCR产物8 μL ，MSPI 1 μL，10×Cut Buffer 1.5 μL，ddH2O 2 μL.酶切时间为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h.将酶切产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照.

1.8 敏感性、重复性酶切的PCR-RFLP分析

将初始浓度为1 μg·μL-1的PCV-2d克隆质粒用ddH2O进行10倍稀释，共设置7个梯度，以稀释后的DNA为模板，进行PCR扩增，并将PCR产物进行酶切，最后将酶切产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照.

1.9 PCR-RFLP方法在临床样品检测中的应用

将临床已确定为PCV2的24份DNA进行PCR，对PCR产物用MSPI酶进行酶切，最后将酶切产物经1%琼脂糖凝胶120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统观察反应结果并拍照.

2 结果与分析

2.1 特异性试验结果

M:DNA分子质量标准;1:PCV2;2:CFV;3:PR;4:PRRSV;5:PEDV.图1 PCR特异性试验结果Fig.1 The result of PCR specific test

用oligo7设计的引物，PCV2-702能够扩增与预期相符合的条带.以猪瘟病毒(CFV)，伪狂犬病毒(PR)，蓝耳病毒(PRRSV)，流行性腹泻(PEDV)的DNA或cDNA为模板，分别进行PCR扩增后进行凝胶电泳，并未见明显扩增条带(图1).

2.2 PCR反应体系的优化结果

退火温度的优化结果表明，退火温度为58 ℃时，PCR产物无杂带(图2A).模板量的优化结果表明，模板量为2 μL时，PCR产物与大于2 μL时的亮度差异不显著(图2B).循环数的优化结果表明，循环数为35个循环时，PCR产物与40个循环的亮度差异不显著(图2C).因此，PCR的反应体系25 μL,模板2 μL，Eeay Taq Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL.PCR反应条件：95 ℃变性5 min，95 ℃变性30 s，退火58 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s， 35个循环，72 ℃延伸10 min为最优化的PCR反应体系.测序结果的遗传进化树和同源性分析结果表明，该引物的扩增产物正确(图3).

A:退火温度优化PCR试验结果(M:DNA分子质量标准;1:50 ℃，2:52 ℃，3:54 ℃，4:56 ℃，5:58 ℃)；B:模板量优化PCR试验结果(M:DNA分子质量标准;1:1 μL;2:1.5 μL;3:2 μL;4:2.5 μL;5: 3 μL;6:3.5 μL)；C:循环数优化PCR试验结果(M:DNA分子质量标准;1:25个循环；2：30个循环；3：35个循环；4：40个循环).图2 PCR反应的优化结果Fig.2 Optimization results of PCR reaction

图3 测序基因遗传进化树Fig.3 Sequenced genetic evolution tree

2.3 PCR产物的RFLP

M：DNA分子质量标准；1：PCV-2d基因型的PCR产物未酶切；2：PCV-2d基因型的PCR产物酶切.图4 PCR产物酶切结果Fig.4 Enzyme digestion result of PCR product

用MSPI限制性内切酶对PCV-2d基因型的PCR产物进行酶切.结果表明，PCV-2d型病毒可被酶切出2个条带，且与预期的酶切片段长度符合(图4).

2.4 PCR-RFLP体系酶量、酶切时间条件优化结果

PCR-RFLP酶量的优化结果表明，当酶量为1.0、1.5、2 μL时，条带亮度差异不显著(图5A)；酶切时间的优化结果表明，当酶切时间为1 h时，条带亮度最为明显(图5B).由此可见酶切体系12.5 μL，PCR产物8 μL，MSPI 1 μL，10×Cut Buffer 1.5 μL，ddH2O 2 μL.酶切时间1 h为最优化的PCR-RFLP的反应体系.

2.5 敏感性、重复性酶切的PCR-RFLP分析结果

PCV-2d敏感性的PCR-RFLP结果表明，重复性的的PCR-RFLP结果表明，PCV2d的PCR-RFLP重复性好(图6A).当DNA稀释倍数为100倍时，仍能有酶切结果，100倍以上的稀释梯度则看不到酶切结果(图6B).

A：PCR-RFLP体系酶量的条件优化电泳图(M：DNA分子质量标准;1：MSPI 0.25 μL；2：MSPI 0.5 μL；3：MSPI 1 μL；4：MSPI 1.5 μL；5：MSPI 2 μL);B：PCR-RFLP体系酶切时间的条件优化电泳图(M：DNA分子质量标准;1：酶切0.5 h；2：酶切1 h；3：酶切1.5 h；4：酶切时间2 h；5：酶切时间2.5 h).图5 PCR-RFLP体系优化结果Fig.5 Optimization results of PCR-RFLP

2.6 敏感性、重复性酶切的PCR-RFLP分析结果

临床送检的确定为PCV2的24份病料，能被MSPI酶切的有8份，PCV-2d阳性率为33.3%(图7).

A：PCR-RFLP的重复性电泳图(M：DNA分子质量标准;1、3、5:MSPI酶切;2、4、6:未用酶切);B：PCR-RFLP的敏感性分析电泳图(M：DNA分子质量标准;1：DNA为原浓度；2：DNA稀释10倍；3：DNA稀释102倍；4：DNA稀释103倍；5：DNA稀释104倍；6：DNA稀释105倍；7：DNA稀释106倍).图6 敏感性、重复性试验结果Fig.6 Specificity and sensitivity test results

M:DNA分子质量标准;1:-24:临床待测样品.图7 临床样品的检测结果Fig.7 Test results of clinical samples

3 讨论

2000年以来，郎洪武首次报道国内PCV2的存在，该病毒引起的相关疾病严重影响了猪群的健康，给养猪业造成严重的经济损失[13].2006年，我国爆发的无名高热也与PCV2的感染有关[14].不同地区的流行病学调查显示，浙江省及周边地区2007至2012的PCV2阳性检出率为41.4%；山西2010—2012年PCV2阳性检出率为56.98%；而广西在2012—2015年的PCV2的阳性率达50.7%[15-17].以上的数据表明PCV2感染严重影响着我国不同地区的养猪业.目前，并未见PCV2有发生明显变异的相关报道，但同一地区存在多种血清型并不鲜见.当前，市面上流通的PCV2疫苗的均为2 a基因型的灭活苗或亚单位疫苗[18].有研究表明，PCV-2a可以与PCV2b产生交叉保护，但PCV-2a并不能为PCV-2d提供完全保护[12].因此在临床上，出现猪群免疫了疫苗却还是发病的情况，这可能与发病基因型和注射疫苗的基因型不符合有关.可见PCV2基因型的诊断显得尤为重要.

本研究利用PCR-RFLP方法，并通过不同的限制性内切酶的配合使用，可对现在流行的PCV-2d基因型进行鉴别，操作简便、可靠.PCR-RFLP技术是在PCR技术基础上发展起来的，是分子生物学的重要分析方法之一.1980年DAVID et al[19]建立了限制性片段长度多态分析方法，该方法能够对某些核酸序列进行切割，使其核酸分成若干个片段.本研究利用PCR-RFLP技术对PCV-2a、PCV-2b和PCV-2d进行酶切分析，根据酶切产生的片段的不同，从而鉴别PCV2d的基因型.通过设计针对PCV2的特异性引物，并对PCR-RFLP反应体系和反应条件进行了优化，建立了能够进行快速、准确鉴别PCV2d基因型的检测方法.该鉴别方法，对于进一步研究PCV-2d的流行情况，致病机理，防控措施具有重要的意义.