褪黑素对博来霉素诱导肺纤维化小鼠α-SMA和E-cadherin表达的影响

胡青青，周恩敏，金克，杜勇，钱燕，翁华春

（温州医科大学附属第一医院 儿科，浙江 温州 325015）

肺纤维化是许多急性和慢性肺病的常见终末期后遗症，是一种进行性肺病[1]。尽管近年来肺纤维化的治疗有所进展，但大多数患者仍然面临病死的结果，目前唯一的治愈性治疗是肺移植[2]。因此，对肺纤维化机制进一步研究并寻找合适的治疗靶点是必要的。褪黑素由松果体等器官合成，广泛分布于生物体内[3]。研究表明，褪黑素具有抗氧化、抗癌以及免疫调节作用[4]。YEUNG等[5]研究表明，褪黑素可以抑制慢性间歇性缺氧诱导的心肌损伤大鼠纤维化标志物的表达，如TGF-β。DAS等[6]报道褪黑素干预可以消除脂毒性介导的肝星状细胞活化并防止肝纤维化进展。但是目前关于褪黑素对肺纤维化的作用尚未见相关报道，本研究旨在探讨褪黑素对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的影响及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 博来霉素粉剂由日本化药株式会社生产，规格15 mg/支，温州医科大学附属第一医院药剂科提供；褪黑素购自美国Sigma公司；氧化应激试剂盒购自南京建成公司；本实验所使用反转录及RT-PCR相关试剂均购自大连TaKaRa公司；RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）引物由深圳华大基因公司合成；单克隆抗小鼠E-cadherin抗体、单克隆抗小鼠α-SMA抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记的兔抗小鼠IgG购自上海碧云天生物公司；免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组：雄性SPF级C57BL/6小鼠30只，6周龄，20 g左右，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。用博来霉素（5.0 mg/kg）气管内注射制作大鼠肺纤维化模型[7]。随机分为模型组和褪黑素组，每组15只。褪黑素组腹腔注射5.0 mg/kg褪黑素，模型组腹腔注射同等体积的0.9%氯化钠溶液。4周后处死小鼠，提取肺组织进行相关指标检测。本研究动物实验方案由温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2.2 HE染色评估肺组织病理改变：将肺组织进行固定并常规石蜡包埋，将从肺组织的不同部位收集的3个组织块切片至5 μm的厚度。HE染色按照试剂盒说明书操作，用来评估肺组织的病理变化（肺泡炎和肺纤维化）。

1.2.3 肺组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量测定：将肺组织用0.9%氯化钠溶液在冰上匀浆，然后在4 ℃以4 000 r/min离心10 min。上清液用于进一步测量。SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。根据生产商的说明书使用检测试剂盒检测。

1.2.4 免疫组织化学检测肺组织中α-SMA和E-cadherin表达：将肺组织固定并常规石蜡包埋，连续切片，厚度约5 μm。切片脱蜡至水，用柠檬酸钠进行抗原修复，用3%双氧水灭活内源性氧化酶，加入一抗（1:100）孵育后，加入二抗继续孵育，用DAB溶液进行显色，苏木素复染后封片。视野下棕黄色颗粒为阳性结果，观察蛋白在肺组织中的表达情况。

1.2.5 RT-PCR检测肺组织中炎症因子TNF-α、IL-6以及α-SMA和E-cadherin mRNA的表达：Trizol法提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行目的基因的扩增。TNF-α引物上游：5’-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3’，下游：5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3’；IL-6引物上游：5’-TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3’，下游：5’-GGTACTCCAG AAGACCAGAGGA-3’；α-SMA引物上游：5’-GCACAGCTTCT CCTTGATGTC-3’，下游：5’-CCGAGATCTCACCGACCT-3’；E-cadherin引物上游：5’-AAACCTGATGGATGTGGGATG-3’，下游：5’-GGTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3’；以GAPDH作为内参，引物上游：5’-AACGACCCCTTCATTGACCT-3’，下游：5’-CACCAGTAGACTCCACGACA-3’。反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃60 s，40个循环，各设置3个重复孔，结果以2-△△Ct方法分析细胞基因表达差异。

1.2.6 Western blot检测肺组织中α-SMA和E-cadherin的蛋白表达水平：提取肺组织剪碎后放入液氮进行研磨，加入500 μL蛋白裂解液继续研磨，离心取上清液，用BCA法检测蛋白浓度。加样，经电泳蛋白分离和转膜，于5%脱脂奶粉封闭30 min。一抗孵育（1:1 000），4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗（1:5 000）常温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝胶成像系统显色曝光，经Quantity One进行灰度测量分析。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色评估博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织病理改变 HE染色结果发现，博来霉素诱导的肺纤维化模型组小鼠肺组织肺泡渗出物减少，肺泡结构被破坏；间质间隙明显扩大，细胞外基质增生明显；在肺间质中也观察到成纤维细胞增殖，并且胶原纤维的积聚形成了广泛的纤维化。与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织肺泡腔和肺间质中可见炎性细胞浸润，肺间隔增厚，肺间质中可见少量胶原纤维结构。见图1。

图1 2组小鼠肺组织病理形态改变（HE，×200）

2.2 2组肺组织氧化应激水平及炎症因子表达 氧化应激检测结果发现，与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织SOD活性显著升高（P＜0.05）；与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织MDA表达量显著降低（P＜0.05）。RT-PCR结果发现，与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织TNF-α、IL-6 mRNA表达量显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 2组肺组织氧化应激水平及炎症因子表达（n=15，±s）

表1 2组肺组织氧化应激水平及炎症因子表达（n=15，±s）

与模型组比：aP＜0.05

组别 SOD（U/mg） MDA（nmol/g） TNF-α mRNA IL-6 mRNA模型组 7.30±0.80 441.1±13.7 2.78±0.86 3.56±1.24褪黑素组 13.90±1.00a 252.6± 9.7a 1.43±0.27a 1.06±0.38a

2.3 肺组织中α-SMA和E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平 RT-PCR结果发现，与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达量显著降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA表达量显著升高（P＜0.05），见表2。Western blot结果发现，与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织α-SMA蛋白表达量显著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表达量显著升高（P＜0.05），见图2。

2.4 褪黑素降低肺纤维化肺组织中α-SMA和增加E-cadherin表达 α-SMA蛋白主要分布在肺间质基质和成纤维细胞中，E-cadherin蛋白主要分布在肺泡上皮细胞。免疫组织化学染色观察结果发现，与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织α-SMA蛋白表达量显著降低，E-cadherin蛋白表达量显著升高，见图3。

表2 2组肺组织中α-SMA和E-cadherin mRNA的表达水平（n=15，±s）

表2 2组肺组织中α-SMA和E-cadherin mRNA的表达水平（n=15，±s）

与模型组比：aP＜0.05

组别 α-SMA E-cadherin模型组 1.34±0.21 0.83±0.12褪黑素组 1.03±0.15a 1.13±0.19a

3 讨论

肺纤维化是以纤维化病灶和炎症浸润为特征的致命性肺部疾病。纤维化可发生在气道壁上，如哮喘中较大的气道和慢性阻塞性肺疾病小气道周围或肺实质[8]，会导致肺实质瘢痕形成和肺功能逐渐下降，最终导致呼吸衰竭[9]。阐明纤维化的发生和发展的分子机制和过程，有助于开发新的有效治疗方法。

图2 Western blot检测α-SMA、E-cadherin蛋白表达

图3 免疫组织化学检测α-SMA和E-cadherin蛋白表达（×200）

氧化应激被认为是参与肺纤维化进展的重要分子机制[10]。已有相关研究表明肺纤维化和炎症因子反应紧密相关[11]。IL-6水平降低可以使小鼠肺纤维化减弱[12]。TNF-α可以诱导NF-κB激活促进肌成纤维细胞分化，促进肺纤维化进展[13]。CHEN等[14]的研究报道龙胆苦苷能抑制炎症和纤维蛋白形成的过程，改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。褪黑素主要由松果体在夜间合成并分泌[15]，是一种不依赖受体的自由基清除剂，具有强效的抗氧化和抗炎特性[16]。ZHAO等[17]研究表明褪黑素通过减轻内质网应激，降低内质网应激介导的上皮-间质转化，从而减轻博来霉素诱导的肺纤维化。KARIMFAR等[18]研究报道褪黑素可以通过抑制环氧合酶-2的表达，减弱博来霉素诱导的肺纤维化。与上述文献报道相一致，本研究发现褪黑素可以使肺纤维化组织SOD表达量显著升高，MDA表达量显著降低，降低肺纤维化组织TNF-α、IL-6表达量，抑制肺纤维化小鼠氧化应激和炎症因子水平。

纤维增殖性疾病的特征在于α-SMA的表达量增加[19]，E-cadherin是上皮细胞黏附和表型的主要标志，其减少和丢失是上皮-间质转化的标志，进而导致纤维化形成[20]。博来霉素是临床上一种有效的抗癌药物，主要用于治疗生殖细胞瘤和淋巴瘤，但是其通过诱导肺组织氧化应激和促进炎症反应导致肺纤维化[21]。YOU等[7]报道博来霉素腹腔注射可诱导小鼠肺纤维化。本研究HE染色结果发现，模型组小鼠肺组织肺泡渗出物减少，肺泡结构被破坏；此外，间质间隙明显扩大，细胞外基质增生明显。与模型组比，褪黑素组小鼠肺组织肺泡腔和肺间质中可见炎性细胞浸润，肺间隔增厚，肺间质中可见少量胶原纤维结构，提示博来霉素成功诱导小鼠肺纤维化，褪黑素可以抑制肺纤维化进展。进一步通过免疫组织化学、RT-PCR以及Western blot实验结果发现，褪黑素抑制α-SMA mRNA和蛋白表达，促进E-cadherin mRNA和蛋白表达。提示褪黑素可以通过调控α-SMA和E-cadherin表达抑制肺纤维化进展。

综上所述，褪黑素通过降低氧化应激和炎症因子水平，抑制α-SMA蛋白表达，促进E-cadherin蛋白表达，延缓肺纤维化进展。