HPV58型E6蛋白B细胞表位预测与分析

2018-07-24叶晓鲜毛珊珊宋易玲王路得蒋朋飞朱珊丽张丽芳

温州医科大学学报 2018年8期

叶晓鲜，毛珊珊，宋易玲，王路得，蒋朋飞，朱珊丽，张丽芳

（温州医科大学微生物学与免疫学教研室，浙江温州 325035）

宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第2位[1]，严重影响了女性的健康与生命。研究表明，HPV高危型别（16、18、31、33、58、52等）感染与宫颈癌的发生和发展密切相关，其中HPV16与HPV18型为全球感染的主要型别，而HPV58型是亚洲人中普遍高危感染HPV型别之一，尤其在我国，仅次于HPV16和18型[2]。

HPV高危型别致癌的主要机制是其肿瘤源性蛋白E6和E7。E6蛋白在宫颈上皮细胞中持续表达，通过介导肿瘤抑制基因p53的泛素化降解，诱导和保持宿主细胞转化为肿瘤细胞，而高表达E7蛋白及其产物则通过作用于pRB及E2F-1，促进S期相关蛋白表达，使细胞不断增殖并发生癌变[3]。目前，基于HPV16、18、31、33、52、58等高危型别L1蛋白的病毒样颗粒九价疫苗已经上市，成功地用于预防由高危型HPV感染导致的宫颈癌，然而该疫苗在对高危HPV各型病毒感染的治疗上没有效果。关于HPV58型致病机制的研究相对还是比较滞后，而E7蛋白相关作用的研究报道已有很多，因此，本研究以HPV58型E6蛋白的氨基酸序列为基础，借助计算机网络生物信息学软件，对其B细胞表位及其结构进行预测与分析，为进一步研究HPV58型E6蛋白的生物学特性提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 HPV58型E6蛋白的氨基酸序列从瑞士生物信息研究所的Swissprot蛋白质数据库中检索到E6蛋白氨基酸序列。

1.2 HPV58型E6蛋白的二级结构及三级结构预测分析预测E6蛋白的二级结构分别采用expasy（http://www.expasy.org/proteomics/）在线服务器中的GOR[4]与SOPMA软件[5]。分析预测E6蛋白的三级结构采用expasy在线服务器中的SWISS-MODEL软件。

1.3 HPV58型E6蛋白的跨膜区域分析预测E6蛋白的跨膜区域分别采用expasy在线服务器中的TMPRED与PROTSCALE软件。

1.4 HPV58型E6蛋白的亲水性、表面可及性、抗原性、极性与柔韧性参数预测分析预测E6蛋白的HOOP&WOODS亲水性[6]、Janin表面可及性、Jameson-Wolf抗原性、Zimmerman极性[7]与柔韧性采用expasy在线服务器PROSCALE与DNASTAR软件。

1.5 综合分析综合以上参数分析HPV58型E6蛋白B细胞表位的优势位点，并采用吴玉章等[8]建立的抗原性指数（antigenic index，AI）综合推断HPV58型E6蛋白B细胞的优势表位。

2 结果

2.1 HPV58型E6蛋白的氨基酸序列与理化性质 E6蛋白由149个氨基酸组成，相对分子质量为17.7937 ku，初步推断分子式为C782H1255N233O218S12，等电点（theoretical pI）为9.10，不稳定系数（instability index）为60.99，疏水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.517，数据说明为亲水性蛋白。氨基酸序列见图1。

图1 HPV58型E6蛋白的氨基酸序列（P26555）

2.2 HPV58型E6蛋白的二级结构及三级结构预测 GOR与SOPMA软件预测E6蛋白二级结构的结果无显著差别，均表明E6蛋白柔性区域以无规则卷曲为主，少见转角，33.56% α-螺旋（alpha helix，Hh）、17.45% β-片层（extended strand，Ee）、48.99%无规则卷曲（random coil，Cc）构成，见图2。SWISS-MODEL软件预测HPV58型E6蛋白的空间结构如图3所示。

图2 HPV58型E6蛋白的二级结构

图3 HPV58型E6蛋白的三维结构

2.3 HPV58型E6蛋白的跨膜区域预测 TMPRED与PROTSCALE软件分析E6蛋白的跨膜区域显示，E6蛋白几乎无跨膜区域，为可溶性蛋白，图4显示疏水峰值和亲水峰值的氨基酸分别占所含氨基酸的百分率，亲水值大于0的氨基酸所占的比例超过50%，可认为氨基酸合成的整个蛋白质表现出亲水性，反之为疏水性。

图4 HPV58型E6蛋白的跨膜区域预测

2.4 HPV58型E6蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性与极性参数预测应用HOPP-WOODS预测亲水性参数，Zimmerman预测极性参数与柔韧性参数，DNASTAR中的protean预测抗原性与表面可及性参数，结果显示肽段8～15、27～44、108～127、141～147为可能的B细胞线性表位。见图5、表1。

图5 HPV58型E6蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性与极性参数预测

2.5 HPV58型E6蛋白的综合分析与AI 选择可能的线性B细胞肽段位置（8～15、27～44、108～127、141～147），计算HPV58型E6蛋白B细胞可能的表位区段AI，结果见表2。这些肽段均显示出较好的亲水性、柔韧性、表面可及性及抗原性，在二级结构上易于形成无规则卷曲与转角，初步推断可能为E6蛋白的B细胞优势抗原表位。

2.6 HPV58型E6蛋白B细胞表位同源性匹配分析应用在线软件protein blast分析B细胞表位的氨基酸序列的同源性，HPV58型E6蛋白N端第8～15、108～127肽段的氨基酸序列不仅与HPV58型E6蛋白的氨基酸序列为100%同源性，在HPV型别中也与HPV9型E6蛋白、HPV33型E6蛋白同源性达100%，第27～44、141～147肽段的氨基酸序列在HPV型别中只与HPV58型E6蛋白同源性达100%，见表2。

3 讨论

B表位是抗原蛋白质表面具有特殊结构与免疫活性的化学基团，可被B细胞表面受体或抗体Fab部分特异性识别并结合。在特异性免疫应答中，抗原经抗原提呈细胞加工处理后，向细胞表面抗原受体提呈线性抗原片段，并特异性结合，诱发免疫反应。严格来说，抗原并不是通过其完整分子来发挥作用，抗体的特异性通常是针对表位来实现的[9]。表位作为抗原的核心部分，通常由5～7个相邻连续氨基酸残基组成，一般不超过20个氨基酸残基[10]。随着计算机科学与生物信息学的不断发展，B细胞线性表位预测研究进入不断标准化与广泛性应用，应用特殊性软件对表位进行预测与分析，筛选出B细胞线性表位的优势肽段，这种采用免疫信息学方法进行抗原表位预测，不仅加速新表位的发现及研究，而且降低实验室费用。有关HPV各种型别蛋白的B表位预测的文献报道有很多，如HPV58型E7、HPV16型L1及HPV16、18、33、52、58五种高危型E7蛋白的B细胞线性表位的预测[11-13]。本实验室也已开展了B线性表位预测的工作，如HPV16型E6蛋白，沙眼衣原体Tarp、HPV58型L1蛋白及程序性死亡受体配体-1等的B表位预测及分析[14-17]，由此获得可能的B细胞表位后，经免疫动物获得多克隆抗体血清，验证可以特异性识别天然抗原，因此，进一步证明通过生物信息学能准确预测特异性蛋白的B细胞线性表位。从HOOP等[18]提出以亲水性方案对抗原表位进行预测以来，不同预测方法的发表及发展推动了B细胞线性表位的广泛应用。目前被公认及广泛应用的预测方法为二级结构、亲水性、抗原性、可及性、可塑性及电荷分布方法这6种方法[19]。上述各种预测方法均存在误差，应综合运用以上参数进行预测。首先分析蛋白质的二级结构特点及表位分布的关系，无规则卷曲与β-转角出现频率高代表表位易于在这段氨基酸区域形成，其中无规则卷曲易于盘旋，扭转，而蛋白骨架含有β-转角的则完全倒转方向，形成β-转角的残基以氢键相互紧聚，从而暴露在蛋白表面而突出，形成结构多样且易于嵌合的抗原识别点，然后应用DNASTAR软件进行分析B细胞表位的亲水性、柔韧性、表面可及性及极性，结合AI计算法综合预测，暴露在膜外的区域代表亲水性高，增加与抗体嵌合的概率，结构易于变换代表柔韧性好，与抗体易于嵌合代表表面可及性好，综合以上数据，把符合AI高的氨基酸序列进行蛋白同源性匹配分析，筛选出的蛋白同源性少的氨基酸序列为可能的B细胞表位。

本研究按照上述顺序进行分析，应用生物信息学预测了HPV58型E6蛋白的B细胞表位，筛选出8～15、27～44、108～127、141～147这4段肽段为可能的B细胞线性表位，并进行在线软件BLAST同源性匹配分析，发现肽段8～15、108～127也与HPV型别中的HPV33型E6、HPV9型E6蛋白同源性匹配为100%，肽段27～44、141～147仅见于HPV58型E6蛋白的B细胞。与其他蛋白同源性100%出现频率越低，意味着肽段成为B细胞表位的特异性越强，因此8～15、108～127肽段不适合进行进一步的深入研究，最终得到肽段27～44（ELKCVECKKTLQRSEVYD）、141～147（RPRRRQT）为可能的特异性B细胞线性表位。