香椿老叶黄酮的响应面优化提取及其抗氧化研究

2018-07-24，，，

许昌学院学报 2018年6期

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(许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌 461000)

香椿[Toonasinensis(A.Juss.)Roem]又名香椿芽、香桩头、椿天等，属楝科香椿属落叶乔木，是药食两用植物，在河南、山东、安徽等多地种植[1,2].香椿叶含有黄酮、多酚、三萜类等活性成分[3-5]，具有抑菌、抗氧化、降血糖和抗肿瘤等作用[6,7].市面上现有香椿酱、干制香椿芽、香椿茶和香椿咸菜等产品[1,8].目前，香椿的消费以嫩芽为主，老叶常被废弃.因此，香椿老叶的开发利用具有重要意义.

目前，化学合成物是食品主要的抗氧化剂，植物源抗氧化剂受到普遍关注[9].黄酮类物质作为抗氧化剂具有广阔的应用前景[10].香椿叶中含有丰富的黄酮类物质，用正交实验法优化香椿叶黄酮的超声波提取工艺已见报道[11]；但是基于响应面分析的香椿老叶黄酮的超声波提取工艺未见研究.因此，本研究就对香椿老叶黄酮的响应面优化提取及其抗氧化性能进行研究.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

香椿老叶：2016年8月采摘于河南九棵树农业发展有限公司；芦丁标准品：纯度99.7%，中国药品生物制品检定所.乙醇、Vc、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2、FeCl3、3,5-二硝基水杨酸等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备公司；超声波提取机，济宁天华超声电子仪器有限公司；紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司.

1.3 研究方法

1.3.1 黄酮含量的测定

采用NaNO2—Al(NO3)3—NaOH比色法测定黄酮含量[12].

1.3.2 单因素试验

香椿老叶于鼓风干燥箱(50 ℃)中干燥后，粉碎并过60目筛.取1.00 g香椿老叶粉，研究不同的乙醇浓度(20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%)、料液比(15，110，120，130，140，150，160 g/mL)、提取时间(10，20，30，40，50，60，70 min)、提取温度(30，40，50，60，70，80 ℃)和提取功率(320，400，480，560，640，720 W)对香椿老叶黄酮提取率的影响.

1.3.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取料液比(X1)、提取时间(X2)、提取功率(X3)为影响因素，采用Box-Behnken试验设计，以黄酮提取率(Y)为响应值，进行3因素3水平正交试验，优化香椿老叶黄酮的提取条件.

1.3.4 抗氧化指标测定

根据上述得到的最优工艺，提取香椿老叶黄酮，并烘干(50 ℃)，然后配制成不同浓度的黄酮溶液.测定黄酮的体外抗氧化活性，包括总还原能力[13]、DPPH自由基清除率[14]、ABTS自由基清除率[15]和·OH清除率[16-17].

1.4 数据处理

试验重复3次，使用软件DPS 7.05和Design Expert 8.0.5进行数据统计与分析.

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

由图1可知，当乙醇浓度小于40%时，黄酮提取率随着乙醇浓度的升高而逐渐增加；当乙醇浓度为40%～80%时，提取率则逐渐下降.原因是香椿老叶黄酮随着乙醇浓度的变化，其极性也发生变化，40%乙醇的极性与香椿老叶中黄酮的极性相近，此时的黄酮提取率最高；但是乙醇浓度过高，又会使杂质(如糖类、色素、脂溶性物质等)溶出，干扰黄酮的提取.因此，确定超声波提取香椿老叶黄酮的最佳乙醇浓度为40%.

2.1.2料液比对黄酮提取率的影响

由图2可知，当料液比逐渐增大时，香椿老叶黄酮的提取率先增加后降低.当料液比为130(g/mL)时，黄酮的提取率达到最大值；继续增加料液比，提取率则逐渐下降.原因是料液比在一定范围时，随着提取液料液比的增加，黄酮的溶出也逐渐增加；当固体和液体接触饱和后，再增加提取溶剂的量，杂质就会溶出；另外，料液比越高，后续浓缩工艺需要的时间会更长.因此综合考虑，确定提取香椿老叶黄酮的最佳料液比为130(g/mL).

图1 乙醇浓度对香椿老叶黄酮提取率的影响

图2 料液比对香椿老叶黄酮提取率的影响

2.1.3 超声时间对黄酮提取率的影响

由图3可知，随着超声波提取时间的延长，香椿叶黄酮的提取率逐渐增加；当提取时间为40 min时，提取率最高；再延长提取时间，香椿老叶黄酮的提取率则降低.原因是随着时间的延长，超声波会产生较多的热量，黄酮类化合物的结构将会遭到破坏；而且超声波振幅也会破坏黄酮类化合物的结构.综上所述，确定超声波提取香椿老叶黄酮的最佳时间为40 min.

2.1.4 超声温度对黄酮提取率的影响

由图4可知，随着提取温度的升高，香椿老叶黄酮的提取率也逐渐增加；当提取温度为50 ℃时，黄酮的提取率最高；当提取温度继续升高，香椿老叶黄酮的提取率逐渐下降，其原因是温度过高会使黄酮类化合物降解，但温度过低不利于黄酮类化合物的溶出.因此确定超声波提取香椿老叶黄酮的最佳温度为50 ℃.

图3 提取时间对香椿老叶黄酮提取率的影响

图4 提取温度对香椿老叶黄酮提取率的影响

2.1.5 超声功率对黄酮提取率的影响

由图5可知，当超声波功率为400 W时，香椿老叶黄酮的提取率最大；功率继续增加，提取率则逐渐下降.原因可能是功率过高，超声产生的瞬间高温会破坏黄酮化合物结构，导致杂质溶出，从而影响提取效果.因此确定超声波提取香椿老叶黄酮的最佳功率为400 W.

2.2 超声波提取工艺条件的优化

试验因素水平见表1，表2为Box-Behnken试验结果.用软件Design Expert 8.0.5对表2数据进行分析，以香椿老叶黄酮提取率(Y)为固定量，以料液比(X1)、提取时间(X2)和提取功率(X3)为因变量，建立数学模型方程为

Y=-0.966 85+78.108 20X1+0.224 05X2-0.013 381X3-1.343 20X1X2+0.071 975X1X3+
0.000 002 875X2X3-552.016 00X12-0.002 104 78X22+ 0.000 013 913 7X32.

(1)

图5 超声功率对香椿老叶黄酮提取率的影响

表1 响应面试验因素水平表

表2 试验分析方案及结果

由表3可知，回归模型差异极显著(P=0.004 7)、失拟项差异不显著(P>0.05)，说明该模型拟合度好，可用该模型分析和预测香椿老叶黄酮的提取率.F检验用来判定回归方程中各变量对响应值的影响显著性，概率P越小，相应变量的显著程度越高.A、AB、B2极显著，B、C2显著.回归方程相关系数R2为0.918 1(校正后R2为0.812 8和变异系数为3.29)，说明该模型满足了91.81%的样本空间.

表3 方差分析表#

注：#**，P<0.01，表示差异极显著；*，P<0.05，表示差异显著.

为客观反映料液比与提取时间(AB)的交互作用对香椿老叶黄酮提取率的影响，以其中两个响应变量为x轴和y轴，响应值香椿老叶黄酮提取率为z轴，绘制等高线图和三维响应面图，如图6所示.

图6 料液比(A)和提取时间(C)对香椿老叶黄酮提取率(Y)交互影响的等高线图(a)和响应面图(b)

对式(1)做进一步分析，得到超声波提取香椿老叶黄酮的最优参数为：料液比为120、提取时间为37.61 min、提取功率为480 W，预测香椿老叶黄酮的提取率为3.044%.用最优参数来提取香椿老叶黄酮，测得提取率为(3.051±0.029)%，说明响应面法的优化工艺参数是可靠的.

2.3 香椿老叶黄酮的抗氧化活性

图7为香椿老叶黄酮的总还原能力及·OH、DPPH和ABTS自由基清除率.可知，在所测定的浓度范围内，香椿老叶黄酮具有一定的抗氧化能力.随着黄酮浓度的升高，其总还原能力、DPPH 自由基清除率和ABTS自由基清除率均增大，且呈剂量效应关系；但是对·OH的清除能力差异不明显.香椿老叶黄酮可作为天然食品抗氧化剂，与相关文献[18-20]结论一致.