白桦CESA7基因启动子的克隆与表达分析

朱德财 胡晓晴 赵 桐 田 晶 张 勇 刘雪梅

(东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040)

纤维素作为世界上储存量最大的有机物已被人类充分利用，是植物细胞壁的主要成分，自然界每年有1 800亿吨的纤维素生成[1]。从1996年，Delmer小组首次从植物中克隆出纤维素合成酶基因(Cellulose Synthase/CESA)以来，已经在很多物种中分离得到了纤维素合成酶基因，如在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中得到了10个CESA基因，水稻(Oryzasativa)中含有10个CESA基因[2～3]等。纤维素的合成主要是在纤维素合成酶复合体(Cellulose Synthesis Complex，CSC)中完成，而纤维素合成酶在纤维素合成中起主导作用[4]。目前的研究结果认为3个CESA基因形成一个有功能的纤维素合成酶复合体[5]，拟南芥的CESA4、CESA7和CESA8主要负责次生细胞壁的纤维素合成，初生细胞壁纤维素的合成是由CESA1、CESA3和CESA6及其类似基因CESA2、CESA5、CESA9完成[2,6～12]。水稻中CESA4、CESA7、CESA9突变体显示水稻的茎和叶变脆且容易折断，并且纤维素含量下降。以上的结果表明纤维素合成酶基因在植物细胞壁的形成和植物的生长发育过程中具有关键的作用。

启动子是位于基因上游的5′端能够与RNA聚合酶识别与结合的一段特异的非编码DNA序列[13～14]。它能够决定基因的时空表达特异性与基因的表达强度，在基因行驶功能中起到关键作用，主要由核心启动区、上游元件和应答元件组成。组织特异性启动子能够调控外源基因在特定的组织或器官中进行表达，调节植物的生长发育，同时避免了植物体内营养不必要的浪费，目前在植物的根、茎、叶、花、果实、种子等组织器官中都克隆得到了组织特异性启动子[15]。对基因启动子的研究能够为揭示基因的功能提供一个新的方法，所以近年来成为研究的重点和热点。

白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)属桦木科(Betulaceae)桦木属(Betula)，为喜光、适应性强、耐贫瘠、耐严寒和喜酸性土壤的落叶乔木[16]，具有重要的生态和商业价值。在造纸行业中纤维素含量是关于纸张品质好坏的重要依据，所以研究白桦纤维素合成酶基因对于白桦的开发利用具有重要的意义。本研究克隆得到了BpCESA7基因的启动子序列并对其序列进行了生物信息学分析，最后将得到的启动子序列构建到植物表达载体pBI121-GUS，分别对野生型白桦和拟南芥进行侵染并GUS染色分析其表达特征。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 植物材料

野生型白桦及拟南芥均由本实验室保存。

1.1.2 实验试剂

总DNA提取试剂盒与胶回收纯化试剂盒均购自于天根公司；高保真酶购自于东洋纺公司；限制性内切酶与T4连接酶均购自于NEB公司；35s-pBI121-GUS表达载体由本实验室保存；pMD18-T购自于Invitrogen公司；Na2EDTA购自于天津市永大化学试剂有限公司；K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]购自于博迪化工股份有限公司；Triton-100购自于河南纳川生物技术有限公司；X-GLUC购自于Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 白桦基因组总DNA的提取

以本实验室保存的白桦组培苗为材料提取白桦基因组总DNA。

1.2.2 目的片段的克隆

根据白桦基因组信息(http://birch.genomics.cn/page/species/index.jsp)设计引物并扩增白桦BpCesA7基因上游2 000 bp的基因序列，并由哈尔滨适合生物科技有限公司合成。其中上游引物序列：BpCesA7-promoterF：TCTCAAAATTATCAAGAGGGG；下游引物序列：BpCesA7-promoterR：ATCAATGAGGTGAGGTGGT。PCR反应体系如下：2.5 μL总DNA、5 μL 10×PCR Buffer、上下游引物各1.25 μL、3 μL 2.5 mmol·L-1MgSO4、31 μL无菌水、5 μL 2 mmol·L-1dNTPs以及1 μL KOD-Plus-Neo，总体积50 μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35个循环。目的片段回收、纯化后与pMD18-T克隆载体16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，送至哈尔滨适合生物科技有限公司测序。

1.2.3 启动子序列分析

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析软件，对克隆得到的BpCesA7基因启动子序列进行元件分析。

1.2.4 植物表达载体构建

根据BpCesA7基因启动子序列设计酶切引物，F:CCATCGATTCTCAAAATTATCAAGAGGGG(下划线标记为ClaⅠ酶切位点)，R:CGGGATCCATCAATGAGGTGAGGTGGT(下划线标记为BamHⅠ酶切位点)。从1.2.2中获得的阳性克隆菌株中提取质粒稀释100倍后用酶切引物进行PCR，反应体系和反应程序与1.2.2中基本相同只是在反应程序中退火温度由60℃变为62℃。扩增产物纯化回收后，分别将目的片段和植物表达载体pBI121-GUS进行ClaⅠ和BamHⅡ双酶切，回收纯化的目的片段和植物表达载体通过T4DNA连接酶过夜连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经抗性筛选和菌落PCR检测获得阳性克隆，提取阳性重组质粒DNA，进行PCR鉴定，获得重组植物表达载体，命名为proBpCESA7-121-GUS。

1.2.5 菌液的制备及瞬时转化

通过冻融法将proBpCESA7-121-GUS表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中。挑取农杆菌单菌落在5 mL的LB液体培养基(加入相应的抗生素)中28℃过夜培养，次日上午取1 mL该菌液加入到新鲜的100 mL LB液体培养基(加入相应的抗生素)中再进行培养，待菌液至OD600为0.6～0.7时，6 000 r·min-1离心15 min收集菌体，用于拟南芥和白桦的瞬时侵染。拟南芥转化方法参照郭勇等[17]，白桦转化方法参见李萌等[18]。每个试验取10个植株，重复3次。

1.2.6 GUS染色测定

X-GLUC染色液配制(100 mL)：200 mmol·L-1的pH=7.0的磷酸缓冲液50 mL；100 mmol·L-1的Na2EDTA溶液10 mL；5 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]10 mL；5 mmol·L-1的K4[Fe(CN)6]10 mL；0.1% Triton-100；X-GLUC 60 mg，然后加水定容至100 mL。

用无菌水洗净侵染处理后的拟南芥和白桦将其分别放入50 mL离心管中，各加入GUS染色液浸没植株，37℃恒温培养箱中黑暗染色24～36 h，取出用无菌水洗净，样品用V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1脱色液脱色8 h，前两小时每半小时换脱色液一次，然后取出用无菌水洗净，观察染色结果并拍照。

1.2.7 徒手切片方法

本实验对白桦茎徒手切片方法参照朱登峰等[19]。

2 结果与分析

2.1 白桦BpCesA7基因上游序列的获得

以白桦总DAN为模板PCR扩增，电泳结果显示在2 000 bp处有清晰单一条带，与预期片段大小相近。纯化回收后克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌落PCR方法鉴定阳性克隆，随机选取3个送至哈尔滨适合生物科技有限公司测序比对后显示与在白桦基因组中查找的序列一致，说明我们成功克隆得到了目的基因。

图1 PCR产物电泳图谱 M. DL-2000 Marker；1.PCR产物Fig.1 Electrophoretogram of PCR product M. DL-2000 Marker; 1. PCR product

2.2 白桦BpCesA7基因启动子序列分析

利用PLACE和PlantCARE在线软件对启动子序列进行分析，结果发现该启动子序列中除了含有基本转录元件TATA-box、CAAT-box，同时还含有其它多种作用元件。其中包括7种光响应元件(ACE、BOX4、BOXI、G-box、GT1-box、sp1、boxⅡ)，5种激素响应元件(ABRE、ERE、TGA-element、TGACG-motif、CGTCA-motif)，2种关于叶片形态发育元件(HD-Zip1，HD-Zip2)，1种热激反应元件(HSE)等，因为纤维素是细胞壁的主要成分，而细胞壁在植物抵御生物与非生物胁迫等其他的生物过程中起到关键作用，所以由此推测BpCesA7启动子在植物生长发育过程中起到了关键作用。具体元件及其功能和部分元件位置如表1所示。

2.3 植物表达载体的构建

将PCR产物和35s-pBI121-GUS载体质粒分别进行ClaⅠ和BamHⅠ双酶切。连接转化至大肠杆菌DH5α感受态，挑取8个单菌落进行PCR检测。结果显示在2 000 bp处有清晰条带(图2)。提取质粒经双酶切验证条带大小与预期相同(图3)，经测序比对后验证连接正确，植物表达载体proBpCesA7-pBI121-GUS构建成功。

2.4 白桦BpCesA7基因启动子在白桦中的表达活性

为了研究BpCesA7启动子在白桦中的表达特征我们将构建好的proBpCESA7-pBI121-GUS和35s-pBI121-GUS表达载体通过农杆菌介导的方法转化到白桦组培苗中，并通过GUS染色观察其表达特征。结果显示35 s启动子驱动的GUS基因在白桦苗中全组织表达没有差异，BpCESA7启动子驱动的GUS基因在白桦根、茎、叶中都观察到了GUS活性(图5A)，并且在叶和根中颜色较深表明其在根和叶中表达量较高(图5B,C)，并且其存在组织表达特异性。对白桦茎进行徒手切片显示BpCESA7启动子驱动的GUS基因主要在周皮和木质部表达(图5D)，说明BpCESA7基因在白桦抵御生物与非生物胁迫中起到了一定作用。没有进行转化的白桦野生型幼苗未检测到GUS活性。

表1 启动子顺式作用元件分析Table 1 Analysis of promoter elements

图2 白桦BpCESA7基因启动子序列Fig.2 Promoter sequence of BpCESA7 gene for B.platyphylla

图3 大肠重组质粒的PCR检测 M. DL-2000 Marker；1～8.阳性鉴定产物Fig.2 PCR result of positive E.coli clone M. DL-2000 Marker; 1-8. Positive identification product

图4 重组质粒双酶切鉴定 M. DL-15000 Marker；1.双酶切产物Fig.4 The result of double digestion M. DL-15000 Marker; 1. Double digest product

2.5 白桦BpCesA7基因启动子在拟南芥中的表达活性

将带有35 s启动子和BpCESA7启动子的表达载体转化到莲座叶时期和开花时期拟南芥中，经过GUS染色结果显示在莲座叶时期拟南芥中全都表达(图5E)并且BpCESA7启动子驱动的GUS着色较35 s启动子驱动的GUS着色深，表明BpCESA7启动子在拟南芥中具有转录活性，并且莲座叶时期表达量较高，在此时期可能起到了关键作用。在开花时期(图5F)染色结果显示在拟南芥的根，叶，萼片，雌蕊中都有表达，并且在根中的染色最深(图5G～K)，表明其在根的表达量高于其他部位，说明BpCESA7基因除了在营养生长中起到了关键作用同时在生殖生长中也具有一定作用。以上结果也说明BpCESA7启动子具有启动子活性。

3 讨论

纤维素在人类生活中具有重要的作用和人类的生活息息相关，探究纤维素合成基因的表达特征对于研究纤维素合成具有重要的现实意义。纤维素合成酶(CESA)是合成纤维素的关键酶，本研究通过PCR技术克隆得到了白桦纤维素合成酶基因CESA7的启动子并对其序列进行了分析，同时通过农杆菌介导的转化方法在白桦以及拟南芥中的表达模式进行了分析。

启动子中的顺式作用元件对于基因的时空表达及表达量具有重要的调控作用[13～14]，BpCESA7启动子中除了含有高等植物具有的共有元件之外还含有多种不同顺式作用元件，例如光响应元件(ACE、BOX4、BOXI、G-box、GT1-box、sp1、boxⅡ)、激素响应元件(ABRE、ERE、TGA-element、TGACG-motif、CGTCA-motif)、关于叶片形态发育元件(HD-Zip1，HD-Zip2)、参与防御和应激反应顺式作用元件(TC-rich repeats)、热激反应元件(HSE)等。由以上结果推测BpCESA7基因对于植物的生长发育具有重要的调节作用。并且研究BpCESA7启动子元件为揭示BpCESA7基因功能具有重要参考价值。

通过农杆菌介导的转化方法将含有BpCESA7启动子序列的表达载体转到白桦与拟南芥中，结果显示在白桦的茎、叶中检测到了GUS活性。这与Liu等[20]研究BpCESA7在茎和叶中表达量高度相同，同时我们也在根中检测到了GUS活性。对茎进行徒手切片结果显示其主要在木质部和周皮表达，拟南芥AtCESA7[9]和亚麻LuCESA7[21]均被证实是关于次生细胞壁形成的基因，水稻OsCESA7[22]突变体表现出纤维素含量下降的特征是纤维素合成的关键基因，以上结果证明BpCESA7可能也是关于次生细胞壁的形成和纤维素的合成。对拟南芥花的染色结果显示在萼片和雌蕊中检测到GUS活性，这与Liu等[20]BpCESA7在白桦雌花中表达这一结果相似，并且水稻OsCESA4[23]在水稻雌蕊中表达，以上结果表明BpCESA7可能参与花发育过程。同时在拟南芥和白桦的叶片中都检测到了GUS活性，Liang等[24]研究表明在拟南芥叶片中拟南芥AtCESA7参与蒸腾效率的控制，猜测BpCESA7可能也会参与到蒸腾作用中。对于BpCESA7基因启动子研究显示BpCESA7基因在植物生长发育过程中具有不同的时空表达模式，可能参与不同的生物学过程，具体功能还需进一步实验验证。

对于BpCESA7启动子的研究为探究其功能提供了新的思路。本研究旨在为研究白桦纤维素合成机制奠定基础。

图5 proBpCESA7在拟南芥和白桦中的活性分析 A～D.白桦组织(A.白桦组培苗，B.叶，C.根，D.茎及切片)；E～K.拟南芥组织(E.莲座期，F.开花期，G.茎，H.叶，I.花，J.花器官，K.根)Fig.5 Activity analysis of proBpCESA7 A.thaliana and B.platyphylla A-D. Birch tissue(A. Birch tissue culture seed, B. Leaf, C. Root, D. Stem and slice); E-K.Arabidopsis tissue(E. Rosette, F. Flowering, G. Stem, H. Leaf, I. Flower, J. Floral organ, K. Root)

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