镉离子对文蛤鳃上皮细胞超微结构的影响

甄静静，叶方源，王 都，倪小英，应雪萍

( 温州大学 生命与环境科学学院，浙江 温州，325027 )

随着沿海经济的快速发展和海洋资源的快速开发，近岸海域受重金属污染越来越严重[1-2]。在海洋环境中，有毒金属在沉积物和海洋生物中积累，然后通过食物网转移到人类。因此，海洋生物中重金属含量的检测和评估变得越来越重要[2]。镉为非降解型有毒物质，易被生物富集并有生物放大效应， 严重威胁人类和水生生物的生存[1]。重金属镉可通过两种途径进入生物体内，一是通过鳃吸收水体中的镉离子再由血液循环运送至动物体内各个部位；二是在摄食过程中经由消化道进入动物体内[3]。溶解的及颗粒状的金属可通过跨膜通道或细胞内吞作用进入溶酶体或囊泡，随后通过血液排泄或运输[4]。有研究表明，鳃长时间与流动水体接触，相比其他器官更易受到重金属的污染，已被鉴定为双壳类动物重金属积累的主要器官[4-6]。重金属可通过干扰鳃上皮细胞的离子运输进入鳃组织，从而损坏鳃的渗透压调节和呼吸功能[7]。翡翠贻贝(Pernaviridis)[8]主要通过鳃器官来富集污染物，故研究鳃的超微结构有助于了解污染物富集规律。镉离子导致中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)鳃叶增厚、血腔增大、上皮层破坏、线粒体膨胀直至解体，直接影响鳃组织的能量代谢、离子主动转运机制及渗透压调节能力[9]。

双壳类动物的鳃是重金属富集的主要靶器官之一[4-6]，能最初反应出重金属对机体的损害，其组织病理学的改变常被用作检测水生生物健康和水环境中重金属污染的有效和灵敏的标志物之一[2,6-7,10]。此外，双壳类动物因其埋栖的生活方式、广泛的地理分布、种群密度高且易于积累污染物等特点，被广泛应用于实验室或野外的重金属生物累积效应试验[4-7]。文蛤(Meretrixmeretrix)主要生活在潮间带泥沙中，采用滤食的摄食方式，移动性较低，易受重金属污染，故常被用作重金属污染的指示生物[11-12]。

镉会破坏鳃的结构，且对其呼吸功能及渗透功能产生影响[1,13]。目前关于镉对文蛤的研究主要集中在急性毒性[14]、肝胰腺超微结构的影响[15]及生理生化指标影响[16-18]，未见镉对鳃上皮细胞超微结构影响的报道。笔者通过不同剂量的镉离子对文蛤的短期染毒作用，利用透射电镜对其鳃上皮细胞的超薄切片进行观察，研究不同质量浓度Cd2+对文蛤鳃上皮细胞超微结构的影响，进一步探究Cd2+在双壳类动物鳃中的积累和急性毒性效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用文蛤于2015年7月购自温州灵昆贝类养殖场。化学纯氯化镉购自上海天莲精细化工有限公司，将其配制成120 mg/L母液，根据试验需要，用盐度15的人工海水稀释成不同质量浓度的Cd2+溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 体外镉暴露法染毒与处理

根据文蛤96 h的半致死质量浓度(15.01 mg/L)[15]的10%、20%、40%、80%设置4个染毒剂量，分别为1.5、3、6、12 mg/L，同时设对照组。每个质量浓度设3组平行样，每组选取体型相近、活动正常、生长状况良好的文蛤10枚，在室温20 ℃、pH 8的环境中进行养殖，每24 h换水一次，期间不投饵，染毒时间为5 d。

1.2.2 超薄切片制作与观察

染毒结束后，解剖文蛤并迅速取出鳃，切成1 mm3小块，在2.5%戊二醛固定液中于4 ℃冰箱内固定2 h以上。0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液漂洗3次后，1%锇酸固定。之后用磷酸盐缓冲液漂洗3次，蒸馏水漂洗2次。再用1%醋酸铀染色，丙酮梯度脱水，Epon 812环氧树脂包埋、聚合。1%醋酸铀染色，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，LKB-2088型超薄切片机切片，醋酸铀—柠檬酸铅双重染色后，日立-7500透射电镜观察并拍照。

2 结 果

2.1 对照组文蛤鳃上皮细胞超微结构

对照组文蛤鳃上皮细胞核呈圆形或椭圆状，核膜完整，核内物质清晰可见(图1a)。线粒体呈椭圆形，排列规则，大部分线粒体嵴结构完整(图1b～d)。微绒毛分布在细胞表面，排列紧密，无空泡化现象(图1b～d)。细胞膜完整、界限清晰、细胞排列紧密(图1c～d)。

2.2 1.5 mg/L Cd2+染毒组文蛤鳃上皮细胞超微结构

在1.5 mg/L Cd2+染毒组中，鳃上皮细胞核结构基本完整，呈椭圆形，少数细胞的核出现轻微的变形，核膜有轻度的囊泡化现象(图1e～f)。微绒毛排列齐整，大部分未出现分解情况(图1e)。线粒体排列整齐，嵴结构清晰，但有少部分嵴发生断裂现象(图1f,g)，且有少部分线粒体形状发生变形，内部出现空泡状(图1h)。上皮细胞中开始出现溶酶体，但体积较小，仅含极少量的沉积物(图1f,h)。

2.3 3 mg/L Cd2+染毒组文蛤鳃上皮细胞超微结构

在3 mg/L Cd2+染毒组中，鳃上皮细胞核内物质逐渐开始解体(图1i)。核膜囊泡化现象较严重(图1j,k)。微绒毛有脱落现象，排列较松散(图1i,j,l)。线粒体数量稍有增加，体积有所增大，部分线粒体中嵴解体较严重(图1j,k)。细胞中溶酶体数量与低质量浓度染毒组相比有所增加，且体积开始增大，溶酶体中的沉积物不断增多(图1l)。

2.4 6 mg/L Cd2+染毒组文蛤鳃上皮细胞超微结构

在6 mg/L Cd2+染毒组中，鳃上皮细胞微绒毛进一步解体，并出现大量脱落现象(图2a)。线粒体肿胀现象明显，形状不规则，嵴进一步解体(图2a,b)。溶酶体数量增加，内部沉淀物明显增多(图2a,b)。细胞核形状严重变形，核膜多处内陷，且核膜囊泡化现象越来越严重(图2c)。

2.5 12 mg/L Cd2+染毒组文蛤鳃上皮细胞超微结构

在12 mg/L Cd2+染毒组中，鳃上皮细胞中线粒体排列混乱，形状变形，大部分线粒体嵴发生断裂，空泡化程度越来越严重(图2d)。细胞核严重变形，核膜解体破裂，核内物质溢出(图2e)。溶酶体的数量增加，沉积物增多(图2f)。微绒毛大量脱落，出现严重的空泡化现象，细胞器基本泡状化(图2d,f)。

3 讨 论

镉是一种有毒的重金属，它能诱导动物产生氧化损伤，影响生物的组织结构，从而引起严重的退行性病变[1,14-18]。近年来，人们已逐渐认识到基于化学分析的环境重金属污染风险评估不能清晰、直观地表明污染物对水生生物的毒性作用[5]。已知亚致死水平的重金属会影响细胞的结构，进而导致许多海洋生物的重要功能受损，因此用细胞超微结构变化来预测环境中重金属污染的手段越来越受到人们的重视[5-7,15,19]。镉主要积累在肾、肝、鳃3个靶器官中，其中，鳃是至少能螯合或解除镉作用的重要器官[10]。鳃由各种柱状上皮、鳞状细胞和黏液细胞组成，是贝类与水体进行气体交换、排泄、渗透压调节、过滤食物、保护层的形成和上皮表面润滑等作用的主要器官[7]。鳃结构的受损，会影响生物体的呼吸和进食，破坏生物体内离子平衡，严重时甚至导致生物体的死亡[1,6,20-21]。本研究发现，即使是短期暴露于不同质量浓度的Cd2+也会导致鳃上皮细胞结构的损伤，其损伤程度与Cd2+暴露质量浓度成正相关，主要体现在细胞核、线粒体等主要细胞器及微绒毛等的影响，这与已有的研究结果相似[1,4,6,15,19-20 ]。Wang等[22]的研究也表明，随着Cd2+质量浓度的升高和染毒时间的延长，河南华溪

图1 0、1.5、3 mg/L Cd2+文蛤鳃上皮细胞超微结构 a～d为对照组鳃上皮细胞； e～h为1.5 mg/L Cd2+染毒组鳃上皮细胞； i～l为3 mg/L Cd2+染毒组鳃上皮细胞. a: 结构完整的细胞核(比列尺=2 μm)；b: 结构完整的线粒体和微绒毛(比列尺=0.5 μm)； c: 示细胞紧密排列(比列尺=1 μm)； d: 微绒毛和细胞结构(比列尺=1 μm)； e: 紧密排列微绒毛及稍变形的细胞核(比列尺=1 μm)；f: 溶酶体和线粒体(比列尺=0.5 μm)； g: 线粒体(比列尺=0.5 μm)；h: 溶酶体和轻度空泡化的线粒体(比列尺=0.5 μm)； i: 核物质流失的细胞核(比列尺=2 μm)；j: 部分微绒毛解体，核膜肿胀(比列尺=0.5 μm)； k: 线粒体内嵴解体(比列尺=0.2 μm)；l: 溶酶体的数量增多，体积增大(比列尺=0.5 μm). Ly.溶酶体； M.线粒体； Mc.线粒体嵴； Mv.微绒毛； N.细胞核.

图2 6、12 mg/L Cd2+文蛤鳃上皮细胞超微结构a: 6 mg/L Cd2+组，示微绒毛的进一步解体(比列尺=0.5 μm)；b: 6 mg/L Cd2+组，示溶酶体(比列尺=0.5 μm)；c: 6 mg/L Cd2+组，示细胞核变形、核膜泡化(比列尺=0.5 μm)；d: 12 mg/L Cd2+组，示线粒体和微绒毛的解体、变形(比列尺=0.5 μm)；e: 12 mg/L Cd2+组，示严重变形的细胞核(比列尺=0.2 μm)；f: 12 mg/L Cd2+组，示溶酶体(比列尺=0.5 μm). Ly.溶酶体； M.线粒体； Mc.线粒体嵴； Mv.微绒毛； N.细胞核.

蟹(Sinopotamonhenanense)鳃的结构受损程度加剧，有明显的时间—含量—效应关系。但Cd2+导致文蛤鳃上皮细胞损伤的机理有待于进一步从生理、生化及分子生物学方面深入研究。

Domouhtsidou等[7]的研究认为，双壳类动物对金属离子的吸附和毒性作用机制应与溶酶体的功能紧密相连。本研究发现，随着Cd2+质量浓度的上升，文蛤鳃上皮细胞中溶酶体的数量和大小都在增加，溶酶体内部的沉淀物颜色加深，可能是重金属处理后水解酶的活性增加，也可能是一种防御反应机制，以补偿重金属暴露后细胞代谢的紊乱。这在美洲牡蛎(Crassostreavirginica)[23]的鳃中也得到了类似的结论，即Cd2+在溶酶体内聚集，溶酶体对重金属积累会产生不溶性颗粒，之后通过滞留或者细胞分泌从而解毒。因此，将积累的Cd2+输送到溶酶体，通过解毒功能减轻潜在的毒性。Giarratano等[24]研究发现，在许多海洋生物的组织细胞内有溶酶体—液泡系形成的有膜包被的高含量重金属颗粒，能起到积累解毒的作用，其中包括铁、铜、铅、锌等重金属。Sokolova等[23]发现，细胞内线粒体的数量会随着重金属染毒质量浓度的升高而增加，并认为可能是为了补偿重金属毒性对生物体结构功能造成影响从而导致的呼吸作用的抑制。本研究发现，Cd2+低质量浓度时文蛤鳃上皮细胞中少数线粒体内嵴断裂现象，线粒体形状尚显规则，随着Cd2+染毒质量浓度的升高，线粒体体积变大，形状变形，大多数嵴逐渐脱落，肿胀和空泡化现象普遍，并出现少量的凝聚现象，但未发现像泥蚶(Tegillarcagranosa)[1]及美洲牡蛎[23]细胞中线粒体数量增多的现象。有研究表明，线粒体的凝聚或肿胀被认为是对动物细胞中重金属毒性的一种病理反应[1,6-7,15,23]。Green等[25]研究表明，细胞结构功能的破坏可能导致有毒物质在线粒体内积累，影响线粒体的基本功能，导致细胞因能量障碍而凋亡。因此，线粒体损伤在细胞凋亡中也发挥关键作用[17,22,25]。

研究表明，鳃表面的微绒毛能增大上皮细胞表面积，有利于鳃的呼吸和离子转运的作用[6-7,21,26]。本研究发现，随着Cd2+染毒质量浓度的升高，鳃丝微绒毛由原来数量众多、整齐排列的结构逐渐演变成数量减少甚至大量脱落的现象。文蛤鳃丝微绒毛数量的下降可能因为文蛤对重金属的吸收后导致细胞结构破坏，也意味着器官正常的功能可能出现紊乱，包括水过滤不足，气体交换不足和滤食减少等，这与已有的研究结果一致[1,5,26 ]。Sunila[26]研究重金属离子对紫贻贝(Mytilusedulis)的影响时也发现，在重金属离子作用下，紫贻贝鳃上皮细胞肿胀变形，微绒毛空泡化且大量脱落，并认为细胞结构的这些变化可能是一种防御机制。鳃丝微绒毛主要存在于鳃组织的黏液细胞和分泌细胞表面，这些细胞作为重金属结合的一个位点，在重金属进入组织前进行捕捉作用，或通过分泌细胞或其他细胞驱逐已吸收的污染物[5,7]。随着动物长期暴露于重金属中，鳃丝形态结构的变化，如上皮细胞的逐渐坏死、脱落和黏液分泌增加、线粒体空泡化等将反映其分子水平上的紊乱，因此识别这些结构的变化将有助于了解动物对金属接触后的早期细胞反应的结果。