菜籽饼粕多糖对小鼠免疫功能的影响

2018-07-23赵荣敏

石家庄职业技术学院学报 2018年4期

赵荣敏

(石家庄职业技术学院食品与药品工程系，河北石家庄 050081)

油菜是我国重要经济作物之一.菜籽油是人们生活主要植物食用油.菜籽饼粕是油菜籽榨油加工后的副产品，可以替代部分饲用蛋白或作为肥料使用.目前，国内生产的菜籽饼粕中蛋白质含量35%～40%，菜籽多糖含量2%左右，植酸2%～3%.由于品种不同，菜籽饼粕中糖的组成成分也不尽相同，但大体上有以下几种:果糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇半乳糖苷、双半乳糖甘油、棉子糖、水苏糖，这些基本组成使得菜籽饼粕中的糖类具有重要的营养价值[1].因此对菜籽饼粕多糖(PRMs)免疫活性的研究有重要的意义.本文从菜籽饼粕中提取多糖，并研究其对小鼠免疫功能的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽饼粕(采用中国农业科学研究院设计的菜籽冷榨设备压榨出)、小白鼠(昆明种，雌雄各半，体重在18～22 g左右，安徽中医学院动物饲养中心提供)、饲料(安徽中医学院动物饲养中心提供)、二硝基亚砜(DMSO,碧云天生物技术公司)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、小牛血清(上海化学试剂有限公司)、RPMI-1640培养基(杭州四季青生物有限公司)、刀豆球蛋白(ConA，杭州四季青生物有限公司)、噻唑蓝(MTT,Sigma公司)、环磷酰胺(CTX,Sigma公司)、绵阳红细胞(SRBC，安徽医科大学动物饲养中心、鸡血(市售健康公鸡)、氢氧化钠、Hanks液、三氯乙酸、无水乙醇、无水乙醚、丙酮.

1.2 仪器与设备

721分光光度计、TDL-50B高速离心机、BIROD Model 680 CO2培养箱、恒温水浴锅、R-201旋转蒸发仪、无菌超净工作台、MCO-17AIC酶标仪、干燥机、96孔细胞培养板、不锈钢镊子、不锈钢剪刀、移液枪及枪头、大孔吸附树脂、透析袋、三角瓶、注射器、电子天平、200目纱布及玻璃器皿等.

1.3 实验方法

1.3.1 PRMs提取及纯化

在本实验中用氢氧化钠做提取剂.精确称取一定量脱脂后的菜籽放入三角烧瓶中，按1∶10的液料比，放入水浴锅热水(温度70 ℃)浸提2 h，残渣再次浸提2 h后抽滤，并合并滤液.用旋转蒸发仪在60 ℃下将滤液浓缩至一定体积，加入10%的三氯乙酸溶液静置过夜以除去蛋白质，离心取上清液.然后通过特1号大孔吸附树脂进行初步纯化，除去游离的黄酮、脂类、蛋白质以及色素等物质，再将处理过的多糖溶液装入3500截留分子量的透析袋中，经自来水流水透析24 h，再经蒸馏水透析24 h.然后用无水乙醇、无水乙醚和丙酮脱色两次，最后将纯化的溶液在冷冻干燥机中干燥或粉末状，得到菜籽饼粕多糖，经检测，纯度大于等于95%.

1.3.2 动物分组和给药方法

将50只昆明小鼠随机平均分为5组，依次为空白对照组、CTX对照组、多糖高剂量组(300 mg/L)、多糖中剂量组(200 mg/L)、多糖低剂量组(100 mg/L).实验前将小鼠预饲养一周，温度23 ℃，相对湿度60%，饮水为自来水，自由饮水，喂养实验鼠专用饲料.对小鼠进行多糖灌胃为期30 d.每日一次，分别按体重计算，高剂量组给药量为0.016 mL/g，中剂量组给药量为0.012 mL/g，低剂量组给药量为0.008 mL/g，对照组灌生理盐水.CTX对照组第5 d起开始注射CTX，采用腹腔注射，注射量为0.024 mg/g小鼠体重，CTX浓度为3 mg/mL.

1.3.3 对免疫器官质量影响

末次给药后的次日，小鼠经眼眶放血处死，用电子天平精确称取小鼠的体质量、胸腺质量、脾脏质量.按以下公式计算小鼠的脾指数及胸腺指数[2].

脾指数=脾重(mg)/体重(g)，

胸腺指数=胸腺重(mg)/体重(g).

1.3.4 对小鼠腹腔巨噬细胞的影响

无菌条件下向小鼠腹腔注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽取腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液.细胞悬液离心速度2000 r/min，离心时间5 min，收集细胞，用Hanks液冲洗一次，用含5%的小牛血清的RPMI-1640培养液悬起腹腔巨噬细胞，浓度控制在2×107个/mL，细胞悬液置入培养瓶，37 ℃培养2 h，吸取上清液，用预热培养基清洗2次，留下贴壁细胞[3]，加入96孔细胞培养板内.设对照组：100 μL细胞悬液+100 μL RPMI-1640培养液+100 mL PBS溶液；阳性对照组：100 μL细胞悬液+100 μL RPMI-1640培养液+50 mL PBS液+50 μL ConA；给药组：100 μL细胞悬液+100 μL RPMI-1640培养液+100 mL多糖溶液(浓度分别为100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L).置37 ℃，5%CO2培养箱中培养48 h后,每孔加入15 μL MTT溶液(浓度为5 mg/mL),再继续培养4 h，离心，弃上清，然后加入30%的DMSO 100 μL，充分振荡后静置20 min，用酶标仪于570 nm处测光密度,分析比较各试验组与对照组的差异,加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表腹腔巨噬细胞的增殖能力[4].

1.3.5 对小鼠溶血素抗体生成的影响

实验分组为空白对照组，多糖低剂量组，多糖中剂量组,多糖高剂量组,末次给药前4 d，每鼠腹腔注射2%SRBC、生理盐水0.01 mL/g小鼠体重进行免疫，并继续给药.于免疫4 d后每鼠眼眶取血，分离血清.取血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1 mL，加5%SRBC 0.5 mL，10%补体(新鲜小鼠混合血清经SRBC于4 ℃吸收30 min)0.5 mL混合，在37 ℃恒温箱中保温30 min后，0 ℃冰箱中终止反应.离心，取上清液于540 nm处测定光密度值.另设不加血清的空白管，取其上清液作空白[5].

2 结论与分析

2.1 PRMs对免疫器官的影响

PRMs对脾指数、胸腺指数的影响见表1.

表1 PRMs 对脾指数、胸腺指数的影响

脾腺和胸腺是体内重要的免疫器官，在淋巴细胞的成熟过程中起着重要的作用，脾指数、胸腺指数是评价机体免疫机能状况的重要指标之一.从表1可以看出，与空白对照组相比，PRMs使小鼠的脾指数、胸腺指数都有所增加，但是不同浓度的 PRMs对其影响程度不同，说明PRMs浓度在一定程度上影响小鼠的脾指数和胸腺指数.与CTX对照组相比效果较明显，注射CTX后的小鼠的脾脏、胸腺有所萎缩,其原因可能是注射CTX会造成免疫器官的永久性萎缩，并且肝脏的颜色与未注射CTX的小鼠的肝脏颜色相比很浅.实验结果表明，该剂量范围内，PRMs可以使小鼠的脾脏和胸腺质量增加，促进其产生免疫细胞，提高免疫功能.

2.2 PRMs对腹腔巨噬细胞增殖反应的影响

PRMs对腹腔巨噬细胞增殖反应的影响见表2.

表2 PRMs 对小鼠腹腔巨噬细胞的影响

从表2数据可知，PRMs能明显促进ConA诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的增殖，与对照组相比效果明显.不同浓度PRMs对小鼠腹腔巨噬细胞的增殖情况的影响不同.100 mg/L浓度的PRMs增殖作用最差，但与ConA诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的增殖情况比较有所增加.其中300 mg/L浓度的PRMs增殖作用最好,200 mg/L 浓度的PRMs增殖活力比300 mg/L浓度的差，但比100 mg/L的浓度的高.所有给药组与对照组相比，增殖作用都明显提高.因此，在该剂量范围内PRMs有促进小鼠腹腔巨噬细胞的增值作用，且效果比ConA明显.