miR-138在鼻咽癌患者中的预后价值及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

王英力， 赵 群， 兰 娜， 王书谦

鼻咽癌是一种发源于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤[1-4]。与其他的头颈部恶性肿瘤相比，鼻咽癌在发生、病因、临床表现以及肿瘤治疗方面存在显著的差别。中国是鼻咽癌高发国家，发病率呈现逐年递增的趋势，因此该病成为我国面临的一个重大健康问题[5]。目前多种抗肿瘤方法已经应用到癌症治疗中，但是鼻咽癌的预后情况仍然不理想[6]。如何进一步改善此疾病的预后，是目前鼻咽癌治疗过程中亟待解决的问题。

microRNAs(miRNAs)是近年来癌症研究领域的热点，具有较高的临床应用价值。miRNAs是一系列非编码的小RNA分子，其长度约为18～22个核苷酸。研究表明，它们可以通过结合靶mRNA的3′非翻译区，从而在转录后水平调控目的基因的表达[7]。此外，miRNAs参与了包括癌症细胞在内的多种生物学过程，如细胞增殖、分化、迁移、侵袭及凋亡过程[8]，说明了其在肿瘤发生和发展过程中潜在的生物学功能。在鼻咽癌细胞中，miR-138作为miRNAs家族一员，被证明具有显著的抑癌作用，但是其临床意义和系统的生物学功能尚未阐明[9]。

本研究旨在分析鼻咽癌组织中miR-138的表达量，探究其在癌症患者中的预后价值，通过检测miR-138对癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，进一步明确其在鼻咽癌发生发展中的作用。

1 对象与方法

1.1对象 选取2006年5月—2011年6月在笔者医院接受肿瘤切除术的118名鼻咽癌患者为研究对象，男性75例，女性43例，年龄(55.6±12.8)岁(30～78岁)。患者纳入标准如下：(1)经组织病理学确诊为鼻咽癌；(2)病史资料详细完整；(3)术前未接受过任何抗肿瘤治疗；(4)无其他系统肿瘤疾病病史；(5)无其他伴发疾病。收集118例鼻咽癌组织，同时取对应的临近正常鼻咽部组织为对照样本，所有组织冻存在液氮中备用。本研究获得医学伦理委员会批准，患者术前均签署了知情同意书。对术后患者进行为期5年的随访，并对患者的生存情况进行记录。

1.2细胞培养及转染 鼻咽癌细胞系CNE1和正常鼻咽上皮细胞NP69均购自中国上海细胞研究所。所有细胞接种于DMEM培养基(含10 %胎牛血清)，并置于体积分数为0.05的CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。培养CNE1细胞至对数生长期，胰蛋白酶处理消化后，接种于6孔板中进行细胞转染。转染载体包括：miR-138-mimic(miR-138模拟物)，miR-138-inhibitor(miR-138抑制物)，NC-mimic(miR-138模拟物阴性对照)和NC-inhibitor(miR-138抑制物阴性对照)，所有产品均购自上海吉凯基因公司。其中转染miR-138模拟物或抑制物的细胞作为实验组，转染阴性对照的细胞为对照组，另外设置未转染细胞为空白对照组。所有转染实验使用Lipofectamine 2000TM试剂实现。将miRNA载体与转染试剂混合均匀后加入细胞稀释液中，混匀后置于培养6 h，更换新鲜培养基并继续培养48 h。

1.3RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 使用Trizol试剂提取样品中的总RNA，通过反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)合成miR-138对应的单链cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒(美国Biosystems公司)配置qRT-PCR反应体系，并在Applied Biosystems 7500 Sequence检测系统进行检测。qRT-PCR的条件为：95 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 20 s，进行39个循环。所有样品中miR-138的相对表达量使用2-ΔΔCt法计算。以U6作为内参基因。

1.4MTT法检测细胞增殖能力 收集对数生长期的转染后细胞，接种于96孔板(细胞密度为1×105mL-1)，分别于0，24，48和72 h时添加50 μL MTT试剂，孵育4 h后弃去孔内培养液，每孔加入500 μL的20% SDS并于室温下孵育过夜。使用酶标仪测定培养液在490 nm处的吸光度值，用以评估细胞的增殖能力。

1.5Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 转染后细胞将接种在不含血清的DMEM培养基中，调整细胞密度为1×105mL-1，吸取150 μL细胞稀释液至Transwell上室中，下室为含有20 %胎牛血清的DMEM培养液作为细胞趋化剂，将小室置于培养箱中培养48 h，取出后使用倒置显微镜观察小室中细胞的数目，随机选取7个高倍视野计数细胞数，用以评价细胞的迁移能力。使用铺有Matrigel胶的Transwell小室检测细胞的侵袭能力。

1.6统计学处理 采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据处理。2组间的差别采用Student’st检验进行分析。miR-138和患者的临床病理特征之间的关系采用卡方检验分析。Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析患者的生存率。采用Cox回归分析确认miR-138在鼻咽癌中的预后价值。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-138在鼻咽癌组织和细胞中的表达水平 经qRT-PCR检测，miR-138在鼻咽癌组织中的表达量较癌旁正常组织显著减低，差别具有统计学意义(P<0.001)。miR-138在鼻咽癌细胞CNE1中的表达量显著低于在正常细胞NP69中的表达量，差别具有统计学意义(P<0.001,图1)。

A：miR-138在鼻咽癌组织和癌旁组织的比较; B:miR-138在鼻咽癌CNE1和正常细胞中的比较.图1 miR-138在鼻咽癌组织和细胞中的表达量水平Fig 1 Expression of miR-138 in nasopharyngeal carcinoma tissues and cells

2.2miR-138表达量与患者临床病理特征之间的关系 将患者以miR-138表达量均值为截断值，分为miR-138低表达组(n=64)和miR-138高表达组(n=54)。结果表明，miR-138的表达量与淋巴结转移(P=0.007)和TNM分期(P=0.003)相关，而与患者的年龄、性别、组织学分型、远处转移以及分化程度无显著的相关性(P>0.05，表1)。

2.3miR-138在鼻咽癌患者中的预后价值 通过5年的随访研究，记录并分析鼻咽癌患者的生存情况，进而明确miR-138表达量与癌症患者总生存率的关系。Kaplan-Meier生存曲线显示，患者的总生存率在miR-138低表达量的患者中较miR-138高表达的患者差，且差别具有统计学意义(Log-rankP=0.002，图2)。

通过Cox单因素回归分析证明，miR-138(HR=2.947，95%CI=1.423～6.103，P=0.004)和TNM分期(HR=2.502，95%CI=1.209～5.178，P=0.013)均与患者的总生存率显著相关；多因素分析结果表明，miR-138(HR=2.308，95%CI=1.059～5.031，P=0.035)和TNM分期(HR=2.306，95%CI=1.044～5.093，P=0.039)是鼻咽癌的两个独立的预后因子(表2)。

2.4miR-138对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 通过细胞转染，获得miR-138表达量显著增加的过表达miR-138鼻咽癌细胞(P<0.01)，表达量显著降低的抑制miR-138表达的鼻咽癌细胞(P<0.01)。MTT结果显示，过表达miR-138可以显著降低鼻咽癌细胞CNE1的增殖能力(P<0.05)，而抑制miR-138表达可以显著促进癌细胞CNE1的增殖能力(P<0.05)；Transwell结果表明，癌细胞CNE1的迁移和侵袭能力在过表达miR-138细胞中显著降低(P<0.001)，而在抑制miR-138表达的细胞中显著增加(P<0.01，图3)。

表1miR-138表达量与鼻咽癌患者临床病理特征之间的关系

Tab1Association of miR-138 expression with clinicopathological features of the patients

临床病理特征nmiR-138 表达量低表达高表达χ2P年龄/岁 ≤ 50 371918 > 50814536性别 女432221 男754233组织学分型 鳞状癌733934 其他(腺癌、黏液表皮样癌)452520淋巴结转移 无542232 有644222远处转移 无623032 有563422分化程度 高度/中等分化703832 低分化482622TNM分期 Ⅰ～Ⅱ572334 Ⅲ～Ⅳ6141200.1810.6710.2580.6120.0510.8217.3070.0071.8010.1800.0000.9908.5660.003

图2 不同miR-138表达量的鼻咽癌患者的Kaplan-Meier生存曲线Fig 2 Kaplan-Meier survival curves for patients with different miR-138 expression

表2 鼻咽癌患者中miR-138表达量的Cox回归分析

3 讨 论

近年来，miRNAs的生物学作用备受关注，研究报道称其可以通过调控相应的靶基因从而参与细胞中各种各样的生命活动[10]。在肿瘤细胞中，大部分受miRANs调控的基因在癌症的发生发展中扮演了重要的角色，因此miRNAs在肿瘤治疗方面具有重要的应用价值[11]。此外，这些在肿瘤样品中表达量发生变化的miRNAs，还被证明具有显著的诊断或者预后价值[12]。例如，Li等发现非小细胞肺癌患者血清中的miR-486表达量上调，可以作为一个有效的诊断标记物应用到癌症治疗中[13]。在膀胱癌组织中检测到的高表达miR-222与患者的总生存率显著相关，证明了其在膀胱癌中的预后价值[14]。

A：转染miR-138模拟物的细胞中miR-138表达量显著上调，转染miR-138抑制物的细胞中miR-138表达量显著下调；B～D：过表达miR-138可显著抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制miR-138表达可明显促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力. 1：未转染；2：miR-138模拟物；3：miR-138模拟物阴性对照；4：miR-138抑制物；5：miR-138抑制物阴性对照. 与未转染组比较：△:P<0.05，△△:P<0.01，△△△：P<0.001.图3 miR-138表达量对鼻咽癌细胞增殖、转移和侵袭能力的影响Fig 3 Effects of miR-138 expression on cancer cell proliferation, migration and invasion

在鼻咽癌患者中，同样发现了一些具有较高临床意义的miRNAs成员，包括miR-744和miR-451[15-16]。但是目前对miRNAs功能的认识有限，尤其是在鼻咽癌发展过程中具有生物学功能的miRNAs分子。因此，本研究对miR-138在鼻咽癌中的表达情况以及生物学功能进行了系统的调查分析，旨在进一步理解miRNAs与癌症的关系，并为鼻咽癌的治疗提供新的研究思路。

本研究使用qRT-PCR检测了118对鼻咽癌组织和对应的癌旁正常组织中miR-138的表达量水平，发现其在癌组织中的表达量显著低于癌旁正常组织，说明miR-138可能是潜在的鼻咽癌抑癌基因。为验证此结果，进一步对miR-138在鼻咽癌细胞CNE1中的表达量进行了探究，同样检测到了较正常鼻咽上皮细胞表达量显著降低的miR-138，提示其可能与肿瘤的发生存在相关性。这一结果与已有研究结果一致[9]，说明miR-138在鼻咽癌中潜在的抑癌作用。采用统计学分析证明，低表达miR-138与患者的淋巴结转移以及TNM分期具有显著的相关性，一定程度上说明miR-138可能参与到了鼻咽癌的肿瘤发展过程中。通过对118例鼻咽癌患者进行为期5年的随访，分析其生存率数据，证明miR-138低表达患者较高表达患者具有较差的总生存率，且低表达miR-138在鼻咽癌患者中是一个独立的预后因子，提示低表达miR-138可能与鼻咽癌的不良预后密切相关。

为了进一步验证miR-138在鼻咽癌发生发展中的作用，本研究使用miR-138模拟物和抑制物，分别构建了体外过表达和抑制表达miR-138的鼻咽癌细胞体系。通过MTT法和Tranwell实验法，证明了过表达miR-138可显著抑制鼻咽癌细胞CNE1的增殖、转移和侵袭的能力，而抑制miR-138的表达则对这些生物学活动有明显的促进作用。以上结果证明，miR-138具有抑制鼻咽癌发展的重要作用。除鼻咽癌外，miR-138在其他肿瘤细胞中也被证明与癌症的发生发展存在相关性，例如在非小细胞肺癌细胞中，miR-138同样被检测到具有抑制癌细胞增殖的作用，在癌症的发展过程中扮演了抑癌基因的角色[17]。miR-138作为抑癌基因在结直肠癌中可以显著降低癌细胞的增殖能力，并影响癌细胞的生长周期[18]。虽然本研究证明了miR-138在鼻咽癌发生发展中的重要作用，但是其发挥抑癌作用的相关分子机制尚不清楚，这将成为未来的研究重心之一。