萝卜籽蛋白提取物对鲟鱼腐败菌抑制作用及其理化性质的研究

李 军，李平兰，王 顺，高 亮，桂 萌,

（1.北京市水产科学研究所，北京 100071；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083）

鲟鱼是我国重要的经济淡水鱼，其产量已达到世界总产量的80%左右。鱼类产品具有高水分、高蛋白的特点，极易滋生微生物而腐败变质，不仅造成了极大的经济损失，同时也为鱼类及其产品的流通、贮藏和销售带来不便。目前水产品保鲜技术主要为冷冻保鲜、化学保鲜及气调保鲜等，但以上方法存在蛋白质变性、营养成分流失和化学品残留等问题[1-6]，因此针对鲟鱼及其加工制品安全、高效防腐技术的研发成为目前亟待解决的问题。

水产品的腐败主要由微生物引起，因此可以通过抑制微生物的活性延缓或阻止其生长，从而对水产品进行防腐保鲜。添加防腐剂是一种方便、有效的食品防腐方法[7-8]。抗菌蛋白（抗菌肽）是植物体内一类重要的活性成分，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌蛋白具有抗菌谱广、高效、环保、不使病原菌产生耐药性等优点，目前正成为水产品新型防腐剂开发的研究热点[9-15]。不同的植物可以产生不同的抗菌蛋白，目前对于多数植物抗菌蛋白抑菌特性的研究都集中于病原菌。Mandal等[16]从椰子汁中提取了3 种抗菌蛋白，它们对大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有一定的抑制作用。Wong等[17]从青豆中提取了一种抗菌肽，它对灰霉菌（Botrytis cinerea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和花生褐斑病菌（Mycosphaerella arachidicola）具有抑制作用。吴海霞[18]利用磷酸盐缓冲液从银杏种仁中提取得到抗菌肽，发现其对青霉菌（Penicillium）、产紫青霉（P. purpurogenum）、沙门柏干酪青霉（P. camemberti）和黑曲霉（Aspergillus niger）具有不同程度的抑制作用。付颖颖[19]对苦瓜蛋白进行了研究，结果表明苦瓜蛋白对啤酒酵母、红酵母、黄曲霉和黑曲霉具有很强的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌也具有一定的抑制作用。鱼类腐败菌主要包括气单胞菌（Aeromonas）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、假单胞菌（Pseudomonas）和希瓦氏菌（Shewanella）等[20-22]，然而目前尚鲜有针对鱼类腐败菌的植物抗菌蛋白的研究。

植物种子的蛋白含量高、成分复杂，多种植物种子蛋白具有抑菌活性，如苦豆子种子、苦瓜种子、银杏种子等[18-19]。根据目前的文献报道，植物种子抗菌蛋白理化性质比较稳定，一般易溶于水或有机溶剂，对热处理和酸碱变化稳定，且不易被消化酶水解[18-19,23-26]。银杏种仁抗菌蛋白对pH值、热及NaCl溶液较为稳定[18]；苦瓜蛋白对紫外线照射稳定，在偏酸性和中性及质量浓度低于0.8 mg/mL的NaCl溶液条件下抑菌效果较好[19]。白萝卜是一种具有极高营养价值的蔬菜，同时也具有促进消化、增强食欲、加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用，在临床中具有一定的药用价值[27-28]。萝卜抗菌蛋白对多种植物病原菌的抑菌活性已得到广泛验证[29-30]，而萝卜种子蛋白对鱼类腐败菌的抑菌特性及其理化性质的研究还鲜见报道。

本研究采用硫酸铵沉淀法从白萝卜籽中提取蛋白，研究了其对来源于冷藏鲟鱼的28 株腐败菌的抑菌作用，同时研究了该蛋白提取物的理化性质。本研究为萝卜籽蛋白提取物作为新型鲟鱼防腐剂的开发和其在水产品防腐保鲜方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌（E. coli）DH5α（指示菌）购于天根生化科技有限公司。受试菌分离于4 ℃冷藏的真空包装和托盘包装腐败鲟鱼肉，具体菌种见表1。

LB液体培养基（每升培养基）：酵母膏5 g、蛋白胨10 g和NaCl 10 g。LB固体培养基（每升培养基）：在LB液体培养基的基础上添加17 g琼脂粉。营养肉汤培养基（每升培养基）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g和NaCl 5 g。营养肉汤固体培养基：在营养肉汤培养基的基础上添加17 g/L琼脂粉。

十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶 美国Sigma公司；中性蛋白酶 北京奥博星生物技术有限公司；KCl、CaCl2、NaCl、MgCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、AlCl3·6H2O、LiCl·H2O、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、PbCl2、MnSO4·H2O、AgNO3、吐温20、吐温-80、司班80 国药集团化学试剂有限公司；NaOH、HCl 北京化工厂；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 索莱宝生物科技有限公司；β-巯基乙醇 Amerson（中国）有限公司；Bradford蛋白质定量试剂盒 天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MP5002电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；冷冻离心机 美国Sigma公司；HWS2型电热恒温水浴锅、LRH生化培养箱 上海一恒科技仪器有限公司；凯氏定氮仪 济南阿尔瓦仪器有限公司；HDL洁净工作台 北京东联哈尔仪器有限公司；微波炉 广州美的厨房电器制造有限公司；雷磁PHS-3C型pH计上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萝卜籽蛋白的提取及蛋白质量浓度的测定

将白萝卜籽粉碎后与1.5% EDTA缓冲液以料液比1∶5浸泡12 h。8 层纱布过滤后所得溶液12 000 r/min离心5 min，收集上清液，边搅拌边添加质量分数80%的硫酸铵，沉淀3 h，12 000 r/min离心20 min，收集沉淀，用去离子水复溶，12 000 r/min离心20 min，上清液即为所需蛋白溶液。将蛋白溶液稀释100 倍，采用Bradford蛋白质定量试剂盒（测定范围为50～1 000 μg/mL）测定溶液中蛋白的质量浓度。

1.3.2 萝卜籽蛋白提取物对鲟鱼腐败菌的抑制作用

选取8 株气单胞菌、7 株假单胞菌、11 株肠杆菌和2 株其他菌属的菌株进行抑菌实验。将28 株鲟鱼腐败菌总数稀释至106CFU/mL，采用牛津杯法进行抑菌实验，吸取1 mL菌液于培养皿中，加入10 mL融化的营养肉汤琼脂培养基进行混合，待培养基凝固后，在培养皿中心放置灭菌烘干的牛津杯（外径8 mm、内径6 mm、高10 mm），用移液枪加入200 μL蛋白溶液，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径。每个处理组重复3 次。

1.3.3 温度对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

取一定质量浓度的蛋白溶液，分别在0、4、25、60、70、80、90、100 ℃水浴30 min。吸取200 μL蛋白溶液，以DH5α为指示菌进行牛津杯法抑菌实验，以未处理的蛋白溶液作为对照，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径，每个样品重复3 次。相对抑菌活力按公式（1）计算。

1.3.4 pH值对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

取一定质量浓度的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH和HCl溶液将其pH值分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃水浴2 h后将pH值调至7.0，取200 μL酸、碱处理过的蛋白溶液，以DH5α为指示菌进行牛津杯法抑菌实验，以未处理的蛋白溶液作为对照，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径，每个样品重复3 次。相对抑菌活力按公式（1）计算。

1.3.5 紫外线照射时间对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

取一定质量浓度的蛋白溶液在40 W紫外灯下分别照射（照射距离20 cm）2、4、6、8、10、12 h和24 h。取200 μL处理过的蛋白溶液，以DH5α为指示菌进行牛津杯法抑菌实验，以未处理的蛋白溶液作为对照，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径，每个样品重复3 次。相对抑菌活力按公式（1）计算。

1.3.6 金属离子对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

将K＋、Ca2＋、Na＋、Mg2＋、Fe2＋、Zn2＋、Cu2＋、Al3＋、Li＋、Co2＋、Ni2＋、Pb2＋、Mn2＋和Ag＋添加到一定质量浓度的蛋白溶液中，使金属离子在溶液中的终浓度分别为10、50 mmol/L和90 mmol/L，37 ℃水浴2 h。取200 μL处理过的蛋白溶液，以DH5α为指示菌进行牛津杯法抑菌实验，以未处理的蛋白溶液作为对照，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径，每个样品重复3 次。相对抑菌活力按公式（1）计算。

1.3.7 表面活性剂对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

选取SDS、EDTA、尿素、吐温20、吐温-80和司班80 6 种表面活性剂。将6 种表面活性剂添加到一定质量浓度的蛋白溶液中，使表面活性剂的终质量分数分别为1%、5%和10%，37 ℃水浴2 h。取200 μL处理过的蛋白溶液，以DH5α为指示菌进行牛津杯法抑菌实验，以未处理的蛋白溶液作为对照，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径，每个样品重复3 次。相对抑菌活力按公式（1）计算。

1.3.8 蛋白酶对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

选取胰蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶4 种蛋白酶，将这4 种蛋白酶分别添加到一定质量浓度的蛋白溶液中，使酶的终质量浓度分别为l、5 mg/mL和9 mg/mL，37 ℃处理2 h。取200 μL处理过的蛋白溶液，以DH5α为指示菌进行牛津杯法抑菌实验，以未处理的蛋白溶液作为对照，37 ℃培养24 h后量取抑菌圈直径，每个样品重复3 次。相对抑菌活力按公式（1）计算。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 萝卜籽蛋白提取物中蛋白质量浓度

采用经典的Bradford法测定蛋白溶液中蛋白的质量浓度[31]。萝卜籽蛋白提取物溶液中蛋白质量浓度的标准曲线为y＝0.360 6x＋0.351 8（R2＝0.991 8）。经过该方法测定，萝卜籽蛋白提取物溶液中蛋白质量浓度为44.56 mg/mL。

2.2 萝卜籽蛋白提取物对鲟鱼腐败菌的抑制作用

微生物是导致食品腐败的主要原因，因此抑制微生物的生长可以有效地对食品腐败进行控制。萝卜籽抗菌蛋白对28 株鲟鱼腐败菌的抑制作用如表1所示。抗菌蛋白对所有受试菌株均具有良好的抑制作用。目前对植物源抗菌蛋白的研究多集中于其对真菌的抑制作用，对细菌抑菌作用的研究较少[18,32-33]。本实验中的气单胞菌、肠杆菌和假单胞菌是水产品中常见的腐败菌[20-22]。结果表明，萝卜籽蛋白提取物对水产品腐败菌具有广泛的抑制作用，具有应用于水产品防腐的潜力。

表1 萝卜籽蛋白提取物的抑菌作用Table1 Antimicrobial spectrum of radish seed protein extract

2.3 温度对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

热处理是导致蛋白质变性的一个主要原因。其原理是高温促进原子和基团的热运动，从而使得稳定蛋白质分子结构的各种因素减弱、肽链松散，使蛋白体系的稳定性降低，可溶解的蛋白含量减少，从而发生蛋白质的变性[34]。

表2 温度对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响Table2 Effect of temperature on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

从表2中可以看出，萝卜籽蛋白提取物在0～80 ℃处理条件下其抑菌圈直径不同程度的减小，但相对抑菌活力仍大于79.00%。这说明抗菌蛋白在低于80 ℃条件下热稳定性较好；温度高于80 ℃时，随着热处理温度的提高，蛋白提取物的抑菌圈直径急剧减小，当温度达到100 ℃时，蛋白提取物相对抑菌活力仅为22.99%。银杏种仁抗菌蛋白高于60 ℃处理即发生显著变性（几乎无抑菌活力），苦瓜抗菌蛋白在64 ℃处理后随着温度的上升抑菌活力呈加速下降趋势（相对抑菌活力小于70%）[18-19]。本研究中萝卜籽蛋白提取物对温度的稳定性要优于银杏种仁抗菌蛋白和苦瓜抗菌蛋白。

2.4 pH值对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

表3 pH值对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响Table3 Effect of pH on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

蛋白质在其等电点附近易发生絮凝，导致可溶性蛋白减少，蛋白质的生物活性下降。大多数植物源抗菌蛋白的等电点大于7，银杏种仁抗菌蛋白和苦瓜抗菌蛋白的等电点分别为8.5和9.6[18-19]。从表3中可以看出，在pH 2.0～8.0范围内萝卜籽蛋白提取物的相对抑菌活力大于72.00%，说明该蛋白提取物在酸性和偏中性的环境中稳定。在pH值大于8.0时，蛋白提取物的相对抑菌活力快速下降，可以推断萝卜籽蛋白提取物等电点在8.0～9.0之间。

2.5 紫外线照射时间对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

有研究报道苦瓜抗菌蛋白对紫外线处理稳定性较强，芽孢杆菌抗菌脂肽经3 h紫外线照射后抑菌活力没有变化[19,35]。从表4中可以看出，紫外线照射0～24 h，蛋白提取物的抑菌活力仍较好（相对抑菌活力大于94.00%）。这说明紫外线照射时间对该蛋白提取物的抑菌活力没有影响。

表4 紫外线照射对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响Table4 Effect of ultraviolet irradiation on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.6 金属离子对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

不同种类、不同浓度的金属离子均会对蛋白质的稳定性产生影响，金属离子对鱼精蛋白的抑菌活力有抑制作用，且电荷数和浓度越高影响越大（Ca2＋＞Mg2＋＞K＋＞Na＋）[36]。从表5中可以看出，当Ag＋浓度为50 mmol/L和90 mmol/L时，蛋白提取物的相对抑菌活力下降了约70%，这说明Ag＋对蛋白提取物的抑菌活力有显著的抑制作用；除Ag＋外，其他13 种金属离子对蛋白提取物相对抑菌活力无明显抑制效果（相对抑菌活力大于90.00%）。金属离子浓度在90 mmol/L时，Ni2＋、Cu2＋和Co2＋均可在一定程度上增强萝卜籽蛋白提取物的抑菌活力（相对抑菌活力大于110.00%）。

表5 金属离子对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响Table5 Effect of metal irons on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.7 表面活性剂对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

食品生产过程中会经常使用一些表面活性剂作为乳化剂，如吐温-80和吐温20等，因此蛋白提取物对表面活性剂的稳定性可用于评估其在食品加工过程中的稳定性。如表6所示，萝卜籽蛋白提取物的抑菌活力因SDS质量分数的增加而显著减弱（P＜0.05），说明该蛋白提取物对SDS稳定性较差。不同质量分数的尿素、吐温20和司班80处理后蛋白提取物相对抑菌活力均大于90.00%，说明该蛋白提取物对尿素、吐温20和司班80稳定性较好。此外，增大EDTA质量分数可以显著增强蛋白提取物的抑菌活力（P＜0.05）。

表6 表面活性剂对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响Table6 Effect of surfactants on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.8 蛋白酶对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响

如表7所示，萝卜籽蛋白提取物经4 种蛋白酶在不同质量浓度分别处理后相对抑菌活力均大于96.00%，说明其对这4 种蛋白酶的稳定性较好，这可能是由于萝卜籽蛋白的空间构象使蛋白酶不易找到酶切位点[35]。不同来源的抗菌蛋白对蛋白酶的敏感性不同，芽孢杆菌分泌的抗菌脂肽bacillomycin L对蛋白酶基本保持稳定，芽孢抗菌脂肽经1 mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶处理2 h后的相对抑菌活力分别为94.86%、86.21%、96.73%和98.89%[35]。而格氏乳球菌的抗菌蛋白garviecin LG 34极易被蛋白酶水解，该抗菌蛋白分别经5 mg/mL木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后完全失去抑菌活力[37]。

表7 不同蛋白酶对萝卜籽蛋白提取物抑菌活力的影响Table7 Effect of proteases on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

3 结 论

萝卜籽蛋白提取物对来源于鲟鱼的28 株腐败菌均具有抑制作用：萝卜籽蛋白提取物对温度、酸处理、紫外线稳定性较好；对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶均具有较好的稳定性（相对抑菌活力大于96.00%）；对Ag＋敏感，而对Pb3＋、Mg2＋、Li＋等13 种金属离子稳定性较好；对尿素、吐温20和司班80稳定性较好，一定质量分数的EDTA可增强其抑菌活力。以上结果表明萝卜籽蛋白提取物对鲟鱼腐败菌具有广泛的抑制作用且理化性质稳定，具有开发成新型鲟鱼及相关水产品防腐保鲜剂的潜在价值。