人细胞基因组AAVS1位点基因定点整合率的荧光定量PCR检测方法

张轶岭,王飞飞,张 春,李文生

(1.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所,中国江苏苏州215163；2.中南大学,中国湖南长沙410083；3.上海爱尔眼科医院,中国上海200336)

基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗目的。基因治疗中最关键的步骤就是如何将外源基因准确安全地导入宿主细胞。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体由于其非致病性、低免疫原性以及光谱性等特点,成为当前最受欢迎的人类基因治疗载体之一。而且,AAV载体是目前唯一能定点整合到人类基因组特定位点的病毒载体[1,2]。外源基因整合位点限制了基因工程化细胞治疗的可靠性和安全性,如果外源基因随机插入基因组,可能激活插入位点附近的原癌基因,引起机体癌变。2011年,Sadelain等[3]提出了基因整合“安全港(safe harbours)”的概念。他们提出的人类基因组上可被当作基因整合“安全港”的3个位点分别是AAVS1位点(the adeno-associated virus site 1)、CCR5 位点(the chemokine receptor 5 gene locus)、人 ROSA26同源位点(the human orthologue of the mouse ROSA26 locus)。AAVS1位点位于人基因组19号染色体,其结构特性已被充分研究清楚,是结构展开且两端带有DNA绝缘体的常染色质。在该区域引入的外源基因序列可稳定表达,且不会影响其他内源基因的表达,并且对细胞的毒性很小[4,5]。AAV在AAVS1的定点整合是在Rep蛋白的参与下完成的。AAVS1位点起始500 bp包含与AAVITR(inverted terminal repeat,AAV基因组两端的倒置末端重复序列)类似的AAV复制蛋白Rep结合元件(Rep binding element,RBE)和末端决定位点(terminal resolution site,trs),这些序列对AAV的整合具有非常重要的作用[6]。AAVS1位点还包含高度保守的Mbs85基因,其起始密码子位于RBE下游的17 nt处,AAV在AAVS1位点的整合可能依赖于Mbs85基因的部分复制[7]。

传统的定点整合率的研究方法为:从稳定转染的细胞中随机选取若干个单细胞克隆,扩大培养后结合DNA印迹法(Southern blotting)分析。操作过程繁琐且耗时。为此,本研究以Rep蛋白介导基因定点整合至人T淋巴细胞基因组AAVS1位点为例,提出一种更简单快速的定量分析AAVS1定点整合率的荧光定量PCR方法。

1 材料和方法

1.1 材料

CELiD微载体:5′端和3′端分别为AAV2的倒置末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR),二者包围着中间的外源基因开放阅读框。CELiD微载体(CELiD-CAR-IRES-neoR)、pCMV-Rep 质粒、AAVS1定点整合外源基因的单细胞克隆细胞株均由中国科学院苏州生物医学工程技术研究所细胞和基因治疗研究中心制备并提供。文中的CAR指的是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)。CELiD和pCMV-Rep共转染细胞将外源基因定点整合于基因组AAVS1位点。

1.2 引物

研究中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具体信息见表1和表2。

1.3 人T淋巴细胞培养及整合株构建

人类外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)使用密度梯度离心法从全血中分离获得。洗涤后的PBMC用T淋巴细胞培养基(以1640培养基为基础,添加10%胎牛血清、50 ng/mL OKT3和500 U/mL IL-2)重悬于T25培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱,隔48 h全量换液。将1×107的细胞轻柔重悬于无血清1640培养液中,添加10 μg CELiD-CAR-IRES-neoR和一定量pCMV-Rep,配成120 μL转染体系。将转染体系加入电转管中,期间应避免气泡形成。电转参数选择750 V/30 ms+300 V/90 ms。取出电转完成的细胞,转移到T淋巴细胞培养基。24 h后转移到选择性培养基(含500 μg/mL G418)。同样数量的未处理T淋巴细胞培养在选择性培养基中作为对照。隔48 h全量换液,培养10 d左右对照细胞全部死亡。收集存活的CAR-T细胞做后续检测。

表1 巢式PCR所用引物Table 1 Primers used for nested PCR analysis

表2 qPCR所用引物Table 2 Primers used for qPCR analysis

1.4 利用巢式PCR定性分析AAVS1定点整合

采用两组巢式PCR,分别检测整合热点上游及下游的整合情况。PCR引物中,一条引物位于重组AAV基因组中AAV-ITR的D序列(D sequence)内,另一条引物位于T细胞基因组的整合位点AAVS1序列内。表1中AAV D-sequence上游引物位于ITR-D sequence内,由于ITR序列为倒置末端重复序列,上下游的ITR序列从5′到3′的序列均相同,因此CELiD载体为正向或反向插入,同一条引物都可以起始扩增,区别在于作为上游引物或是下游引物。热点上游巢式PCR第一轮引物为AAV D-sequence F1和AAVS1-specific R1,第二轮引物为AAV D-sequence F2和AAVS1-specific R2。热点下游巢式PCR第一轮引物为AAVS1-F和AAV D-sequence R1,第二轮引物为AAVS1-F和AAV D-sequence R2。取0.1 μL第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板。采用2×SpecificTMTaq Master Mix体系(近岸蛋白质科技有限公司),即20 μL体系中含100 ng模板(细胞总DNA)、200 nmol/L引物及5%DMSO。PCR反应条件:95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min,25个循环。第二轮PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳观察。

1.5 利用荧光定量PCR定量分析AAVS1位点的定点整合率

采用标准曲线定量法分析细胞AAVS1位点的定点整合率。具体方法如下:1)制备标准曲线样品。将100%AAVS1定点整合的阳性细胞基因组与非整合原始细胞基因组按不同比例混合,配制成100%、50%、10%、1%、0.1%标准品；2)为了将内源AAVS1序列的影响降到最低,在定量PCR之前,首先用一轮普通PCR扩增包含ITRAAVS1结合位点的序列。上游引物AAV D-sequence F位于ITR-D序列中,ITR是反向重复序列,下游引物AAVS1-specific R位于AAVS1整合热点的下游。反应体系及条件同1.4所述；3)用SYBR Green qPCR Master Mix(天根生化科技有限公司)进行荧光定量PCR。取普通PCR产物0.1 μL为模板,以qPCR-F和qPCR-R为引物,采用2×SybrGreen qPCR Master Mix体系(日本TaKaRa公司)。PCR反应条件:94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环。所用仪器为ABI 7500 Real-Time PCR仪,结果用仪器自带软件分析。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察。

2 结果

2.1 人T淋巴细胞培养及整合株制备

在本研究中我们首先利用CELiD载体(含新霉素抗性基因neoR)和质粒pCMV-Rep共转染人T淋巴细胞,转染过后采用G418(500 μg/mL)进行抗性筛选。结果显示,培养10 d左右即可观察到对照组细胞大量死亡(图1B),此时筛选组存活细胞基本具有neoR抗性。图1A为培养10 d的整合人T淋巴细胞株,可见存活细胞开始富集。经过筛选培养,我们最终获得具有G418抗性的T淋巴细胞株并将其用于下一步检测。

2.2 AAVS1定点整合的定性分析

图1 人T淋巴细胞培养及整合株制备(A)将CELiD和pCMV-Rep共转染人T淋巴细胞后,G418(500 μg/mL)筛选第10天所观察到的细胞生长情况。Scale bar=100 μm；(B)抗性培养第10天,对照组细胞基本死亡。Scale bar=100 μm；(C)CELiD载体示意图；(D)整合细胞株制备时间轴。Fig.1 Culture of human T lymphocytes and preparation of integrated cell lines(A)Cotransfection of CELiD and pCMV-Rep into T cells.G418(500 μg/mL)was used to screen the cells,and on the 10th day,the growth of the cells was observed(5×).Scale bar=100 μm；(B)Ten days after being cultured with G418,the cells of the control group were basically dead(5×).Scale bar=100 μm；(C)Diagram of CELiD；(D)Diagram of the procedure for integrated cell line preparation.

为了鉴定CAR-T细胞株的AAVS1位点整合情况,我们首先采用两套巢式PCR方案,分别观察AAVS1整合热点上游和下游的整合情况。两套方案的引物位置如图2A、2B所示,每套方案分别包括两组巢式引物。因为我们的CAR-T细胞为混合筛选的neoR抗性细胞而不是单克隆细胞,所以AAVS1的插入位点会有差异,反映在PCR结果上即是不同大小的条带,而阴性对照无条带。图2C、2D结果显示,AAVS1的整合主要发生在热点的上游。基于此,我们在进一步采用实时荧光定量PCR方法定量检测AAVS1位点的整合率时,qPCR的引物设计主要位于整合热点上游,即不再探测下游的整合情况。

图2 巢式PCR鉴定AAVS1位点的整合情况(A)AAVS1热点上游整合分析的引物设计模式图；(B)AAVS1热点下游整合分析的引物设计模式图；(C)整合热点上游PCR产物的凝胶电泳结果。“P”泳道为阳性对照组,“N”泳道为阴性对照组,中间两个泳道为样品巢式PCR结果,可见清晰阳性条带,证明整合主要发生在热点上游；(D)整合热点下游PCR产物的凝胶电泳结果。两组样品均没有可见的条带,提示几乎没有整合发生在AAVS1热点下游。Fig.2 Identification of AAVS1 site integration by nested PCR(A)The position of primers designed for detecting the integration upstream of the AAVS1 hotspot；(B)The position of the primers for detecting the integration downstream of the AAVS1 hotspot；(C)PCR result of the upstream analyzed by agarose gel electrophoresis.“P” represents a positive control group,“N” represents a negative control group,and two lanes in the middle were nested PCR results.It proved that integration mainly occurs upstream of the hotspot；(D)PCR results of the downstream analyzed by agarose gel electrophoresis.There were no visible bands in either group of samples,showing that almost no integration occurs downstream of the AAVS1 hotspot.

2.3 AAVS1位点的定点整合率

我们将鉴定过的100%AAVS1定点整合的JurkatCAR基因组与普通Jurkat基因组按不同比例混合,配制成 100%、50%、10%、1%、0.1%标准品(图3A)。首先,进行20轮普通PCR,定向扩增ITR-AAVS1接头序列,使PCR产物处于对数增长期,从而能够反映原始样本的浓度。然后,在靠近第一轮普通PCR产物3′端的序列中设计预期产物为126 bp的qPCR引物。图3B所示为建立的标准曲线,可见线性范围较好。由图4B结果可知,AAVS1位点的定点整合率为22.8%。

图4A所示为其中一个样品的扩增曲线图,可见Ct值分布均匀,曲线平滑,阴性对照基本无信号。为了确保qPCR为单一产物,我们对产物进行溶解曲线分析,结果如图4C所示,溶解曲线仅有一个峰值,说明只有单一的产物。进一步将qPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察,结果如图4D所示,产物均为126 bp单一条带,与预期大小相符,且信号强度随整合率高低而变化,能够与qPCR结果一一对应,这进一步说明了qPCR结果的可靠。

3 讨论

基因治疗被越来越多地应用于疾病治疗。基因治疗的常见方法有体内治疗和体外治疗两种。体内治疗是将外源基因直接导入受体内相关的器官组织。体外疗法是通过提取并改造细胞,赋予其新的功能,再将其引入患者体内以达到治疗的目的[8]。AAV作为基因治疗中不可或缺的载体,由于其能够稳定、永久地整合到宿主染色体上,并稳定表达目的基因,日益受到更多科研工作者的关注。在传统的细胞基因工程改造中,γ-逆转录病毒(retrovirus)和慢病毒(lentivirus)是最常用的基因载体,它们能够将外源基因整合到宿主细胞的基因组中,从而使外源功能基因在宿主细胞中长期稳定的表达[9,10]。然而它们的缺点是载体的整合是随机的,靶基因表达受插入位点两侧的宿主DNA序列影响,并可导致插入突变[11]。AAV是目前所知的唯一能定点整合到人类基因组特定位点的病毒载体。基于AAV基因组的载体在AAVS1的定点整合是在Rep蛋白的参与下完成的。AAV定点整合的位点AAVS1已经被证明是安全的基因整合位点。整合在AAVS1位点的基因表达持久而稳定,有实验发现在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell)或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell)分化的过程中,整合到AAVS1位点的基因仍然持续表达[12,13]。

图3 qPCR标准曲线建立方案(A)使用引物AAV D-sequence F和AAVS1-specific R进行20轮普通PCR,扩增包含ITR-AAVS1结合位点的序列。采用鉴定过的100%AAVS1定点整合的JurkatCAR基因组与普通Jurkat基因组按不同比例混合,配制成100%、50%、10%、1%、0.1%的标准品(100 ng/μL)。取标准品和检测样本第一轮PCR产物0.1 μL作为qPCR的模板；(B)标准曲线。Fig.3 qPCR standard curve establishment scheme(A)Amplification of the sequence containing ITR-AAVS1 with primers AAV D-sequence F and AAVS1-specific R.The integrated and unintegrated genomes were mixed together in different proportions to make a dilution series of 100%,50%,10%,1%,0.1%standards；(B)The established standard curve.

图4 样本的qPCR测试结果(A)qPCR扩增曲线图,可见曲线平滑,Ct值分布均匀；(B)标准曲线及样本测试结果；(C)qPCR产物溶解曲线,可见单一峰,说明qPCR产物结构单一；(D)qPCR产物琼脂糖凝胶电泳图,可见产物为126 bp单一条带。“M”泳道为DNA分子量标准,“N”泳道为阴性对照组。Fig.4 qPCR test results of the samples(A)The qPCR amplification curve；(B)The standard curve and sample test results；(C)The qPCR melt curve.It shows that the product of PCR is single；(D)Agarose gel electrophoresis of qPCR products.“M” represents DNA marker,“N” represents a negative control group.

在本实验中,我们利用CELiD载体和质粒pCMV-Rep共转染人T淋巴细胞。人T淋巴细胞为悬浮培养,容易移位,而且分离的单个人T淋巴细胞由于缺乏细胞间信号而无法扩增,导致单细胞克隆筛选工作困难。为此,我们转染过后采用G418(500 μg/mL)进行抗性筛选,结果显示:培养10 d左右即可观察到对照组细胞大量死亡,整合细胞开始富集。

为了鉴定整合细胞AAVS1位点的整合情况,我们首先采用两组巢式PCR方案,分别观察AAVS1整合热点上游和下游的整合情况。由于ITR序列为倒置末端重复序列,因此我们采用的两条AAV D-sequence引物均可起始两个方向的DNA合成。另外,我们在优化巢式PCR的实验中发现,巢式PCR酶的选择和DMSO的添加是实验成功的关键。其中PCR酶宜采用高敏感性的Taq酶,反应体系中添加5%DMSO有助于GC富集序列的PCR反应。同样地,我们采用两轮PCR进行定量。首先采用普通PCR扩增包含ITR-AAVS1结合位点的序列。上游引物AAV D-sequence F位于ITR-D序列中,由于ITR是反向重复序列,因此不论CELiD正向或反向插入,AAV D-sequence F均能起始上游PCR。下游引物AAVS1-specific R位于AAVS1序列内。通过20轮普通PCR,可以定向扩增ITR-AAVS1接头序列,使PCR产物处于对数增长期,从而反映原始样本的浓度。在标准曲线定量法中,标准品由鉴定过的100%AAVS1定点整合的JurkatCAR基因组与普通Jurkat基因组按不同比例混合而成,随后取标准品和检测样本第一轮PCR产物0.1 μL作为qPCR的模板。由于是混合细胞克隆,为避免qPCR产物大小不一致对检测结果产生影响,故在靠近第一轮产物3′端的序列中单独设计预期产物为126 bp的qPCR引物,以保证结果的统一性。

我们通过标准曲线绝对定量,建立了一套定量测定AAVS1位点整合率的方法。相比较于传统的定点整合率的研究方法,即随机选取单细胞克隆扩大培养后进行Southern blotting分析,本实验中的操作方法更加简单省时,而且对于大多不能进行单细胞克隆及多次传代培养的原代细胞,其定点整合的鉴定更适合用本方法。但是,本方法的实施前提是需要有定点整合的阳性细胞株作为标准品,这在一定程度上限制了其应用范围。