PHLD融合蛋白在毕赤酵母中的构建和表达

张新国,郭广君,李 坤,孙巧云,郭思佳,马小弟,马国艳

(兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室,中国甘肃兰州730050)

失眠是一种常见病。随着现代生活节奏的日益加快和竞争压力的激增,失眠症的发生率正逐年增加,并严重影响人类身体健康和社会活动能力[1]。源自美国的调查研究发现,33%的人患有失眠[2]。在欧洲,4%～22%的人受到失眠的严重影响[3]。国内的研究资料显示,中国家庭目前失眠症的发病率也高达10%～20%[4,5]。因此,进行有效、安全的抗失眠药物的研究,已成为当前生物制药领域非常迫切的任务和重要研究方向。

目前,临床常用具有镇静催眠作用的化学合成药物治疗失眠。其中,使用较多的是第二代苯二氮卓类和第三代非苯二氮卓类催眠药物。这些药物都不同程度地存在头晕、头痛、困倦、乏力、呼吸抑制、肝功能损伤等不良反应,甚至较严重的耐药性和依赖性,并伴发反跳失眠现象,亟待更换[6]。

现阶段,国内外有关新一代催眠药物的研究主要集中在第四代内源性催眠物质[7,8]。δ-睡眠肽(delta sleep inducing peptide,DSIP)于1977年被美国学者Monnier等[9]发现,经鉴定是一个相对分子质量为848.98的九肽,氨基酸序列为Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu。由于其主要的生理活性是促进兔的δ波睡眠,因此被称为δ-睡眠肽[10]。自从DSIP被发现以来,关于它的研究从未停止。早在1979年,就有学者报道了δ-睡眠肽及其类似物的合成工作[11]。1981年,Schneider-Helmert等[12,13]将合成的δ-睡眠肽应用于临床,试验结果表明其可延长患者睡眠持续时间和深度,减少梦境,而且对人体无副作用。随后,也有研究报道了利用生物工程技术对δ-睡眠肽进行的改进性研究[14],但是现有的这些研究仍然无法解决δ-睡眠肽存在的半衰期短、生物利用度低等缺点,临床应用仍然遥遥无期[15]。

基于此,本研究设计并构建了一种新的融合蛋白PHLD(PTD-HSA-linker-DSIP),它由蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、连接肽(linker)、DSIP融合而成,采用毕赤酵母进行发酵生产。此融合蛋白既具有DSIP诱导睡眠的活性,又具有HSA半衰期长的特性,并且加入的传导肽可以较好地通过血脑屏障,不会引起体内的免疫反应和过敏之类的副作用。本研究有望为睡眠肽的应用提供新的思路和方法,所得融合蛋白PHLD将会是一种安全有效的新型催眠候选药物。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

大肠杆菌 DH5α、pPIC9K和 pPIC9K/HSA质粒、GS115菌株均为本实验室保存。

1.2 工具酶和试剂

Pfu DNA 聚合酶、Tag DNA 聚合酶、4×dNTP、T4 DNA 连接酶、RNA 酶、EcoR I、Not I、Xho I、HindⅢ、Sal I等均购自MBI Fermentas(加拿大)。Marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司。pUCm-T载体、牛血清白蛋白以及其他试剂如琼脂糖、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR引物合成及序列测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3 培养基配制

LB培养基:胰蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 1.0%,pH 7.0。

YPD培养基:酵母浸出粉1.0%,胰蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%。

MD培养基:YNB 1.34%,生物素4×10-5%,葡萄糖2.0%,琼脂1.2%。

基础盐BSM培养基:甘油4%,H3PO4(85%)2.67%,CaSO4·2H2O 0.093%,K2SO41.82%,Mg－SO4·7H2O 1.42%,KOH 0.413%,浓氨水调节至所需pH值。

①建立乌梁素海水环境监管领导责任制，各旗县区主要领导负总责，监管任务层层分解，做到责任清晰、范围明确、奖惩分明、落实到位。

1.4 pPIC9K/PTD-HSA-linker-DSIP重组质粒的构建

根据基因克隆和剪接重叠延伸聚合酶链反应(splicing overlapping extension PCR,SOE-PCR)原理,以pPIC9K/HSA质粒为模板,分别设计上下游引物,上游为含有PTD序列的引物5′-GAATTCTACGGTCGTAAGAAAAGAAGACAACGTAGACTGATGCACACAAGAGTGAG-3′,简称为 P 上；下游为含有linker和DSIP序列的引物5′-GCGGCCGCTTATTCTCCAGAAGCATCACCACCAGCCCAAGAACCTCCACCAGACCTCCACCAGAACCTCCACCTAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′,简称为D下。利用引物进行PCR扩增就可以得到重组基因片段PTD-HSA-linker-DSIP,简称PHLD。琼脂糖凝胶电泳鉴定回收后,将重组基因片段PHLD与克隆载体pUCm-T连接,扩增后进行酶切。将酶切产物PHLD片段与pPIC9K连接,即可获得pPIC9K/PHLD重组质粒。

1.5 pPIC9K/PHLD毕赤酵母工程菌的构建及高表达工程菌株的筛选

将构建所得的pPIC9K/PHLD单菌落用含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基于37℃条件下振荡培养过夜,随后用DNA质粒提取试剂盒提取pPIC9K/PHLD质粒,所得的pPIC9K/PHLD重组质粒用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。将pPIC9K/PHLD重组质粒用Sal I酶进行线性化处理,即37℃酶切5 h,酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定回收。然后将上述pPIC9K/PHLD重组质粒电转化导入至毕赤酵母GS115,接种MD平板后30℃培养3～6 d。将获得的his+转化子分别点种于质量浓度为0 mg/mL、0.25 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL 的G418平板,30℃培养3～6 d。挑选单菌落接种于50 mL YPD培养基中,30℃、250 r/min培养24 h；取菌液接种至基础盐BSM培养基中,30℃、250 r/min培养,每隔24 h向基础盐BSM培养基中添加甲醇。5 d后取菌液离心获取上清,-20℃冻存用于SDS-PAGE 分析[16]。

1.6 高表达工程菌株最佳诱导时间的确定

从YPD固体培养基上挑取筛选所得的高表达工程菌株,命名为lut1211菌株。将其单菌落接种于50 mL液体YPD培养基中,30℃、250 r/min培养24 h。随后,按照10%的接种量接入基础盐BSM培养基中,30℃、250 r/min培养,每隔6 h收集菌液测定其OD600值,以绘制其生长曲线,并确定最佳的甲醇诱导时间。

1.7 高表达工程菌株发酵周期及表达谱的测定

取lut1211菌株进行发酵培养,至甘油耗尽时加甲醇进行诱导表达。甲醇的添加量为每24 h向基础盐BSM培养基中添加至终浓度为1%,连续诱导8 d,每天取样并将样品离心取上清,用SDS-PAGE及考马斯亮蓝法进行分析[14],绘制融合蛋白表达曲线及蛋白质表达谱。

1.8 PHLD融合蛋白的分离纯化

PHLD融合蛋白的分离纯化采用文献报道的方法[16],简述如下:含有目的蛋白的发酵样品加样到DEAE-cellulose离子交换层析柱,用缓冲液A(0～0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L PBS,pH 7.0)进行线性梯度洗脱,收集目的峰。随后上样到Phenyl Sepharose HP Fast Flow疏水层析柱,用缓冲液B(1.0～0 mol/L 硫酸氨,20 mmol/L PBS,pH 7.0)进行线性梯度洗脱,收集目的蛋白。然后上样到Blue Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱,用缓冲液C(0～2 mol/L NaCl,10 mmol/L PBS,pH 6.0)进行线性梯度洗脱,收集目的峰。最后用Sephadex G-25凝胶色谱进行脱盐处理,冷冻干燥后即可用于进一步的分析。

2 结果

2.1 成功构建pPIC9K/PTD-HSA-linker-DSIP重组质粒

pPIC9K/PTD-HSA-linker-DSIP重组质粒的构建原理如图1A所示。本研究通过SOE-PCR方法成功获得PHLD基因片段,并将含有EcoR I和Not I位点的目标DNA序列亚克隆到pPIC9K/PHLD表达载体中(图1A),得到构建体pPIC9K/PHLD。进一步对阳性克隆测序,验证PHLD基因片段是否成功插入pPIC9K载体。其中PHLD基因的PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后的结果如图1B所示。对于PTD、HSA、DSIP以及连接肽的融合蛋白,其编码基因大小为1 868 bp。由电泳图可知实验结果与理论设计一致。阳性克隆的测序结果见图2,将测序结果(sequence 1)与理论设计序列(sequence 2)进行比对,结果显示PHLD基因已经成功插入pPIC9K载体中。

图1 pPIC9K/PHLD重组质粒的构建(A)pPIC9K/PHLD重组质粒构建的原理图；(B)PHLD重组基因琼脂糖凝胶电泳图。M:DNA marker；泳道1:PHLD基因。Fig.1 Construction of pPIC9K/PHLD recombinant plasmid(A)Schematic diagram for construction of the plasmid pPIC9K/PHLD；(B)Analysis of PHLD gene by agarose gel electrophoresis.Lane M:DNA marker；Lane 1:PHLD gene.

图2 PHLD基因测序比对结果Fig.2 Sequencing alignment results of PHLD gene

2.2 pPIC9K/PHLD毕赤酵母高表达工程菌株的筛选结果

经MD平板和G418抗性平板筛选后,从最终得到的阳性克隆中挑取菌落形态大且饱满的菌株进行摇瓶培养并诱导表达,离心收集发酵上清,SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定,凝胶脱色后用Bio-Rad凝胶照相系统进行拍照分析。结果显示,编号为lut1211的菌株成功表达PHLD重组蛋白且表达量最高,因此将其作为目标菌株进行进一步的研究。

2.3 高表达工程菌株最佳诱导时间的确定

高表达工程菌株lut1211的生长曲线如图3所示。从实验结果中可以看出目的菌株在48 h时达到OD600最大值,表明此时菌体生长停止,甘油耗尽。毕赤酵母甲醇诱导表达中,如果发酵液中含有甘油,将对目的蛋白的表达发生抑制,因此本研究将48 h作为甲醇诱导的起始时间。

图3 高表达工程菌株lut1211的生长曲线图Fig.3 Growth curve of high expression engineering strain lut1211

2.4 高表达工程菌株发酵周期及表达谱的测定结果

PHLD融合蛋白在目的菌株中的表达曲线及蛋白质表达谱如图4所示。由图片结果可知,随着诱导时间的延长,重组蛋白的表达量逐渐增加,蛋白质谱带的颜色也随之加深,目的蛋白的表达量在第5天时达到最大,因此可以确定最佳的发酵周期(放瓶时间)为5 d。此外,由图4B可知,重组蛋白的相对分子质量与牛血清白蛋白的大小相近,与理论一致,说明得到的重组蛋白正确。

2.5 融合蛋白的初步分离纯化

PHLD融合蛋白通过层析柱分离及G-25凝胶脱色脱盐后,采用SDS-PAGE进行分析,结果如图5所示。由图5可知,经多步层析分离纯化后可得到电泳纯样品,所得蛋白质纯度较高,能满足对其进一步评价的需要。

3 讨论

图5 PHLD融合蛋白初步分离纯化电泳图泳道1:纯化后的冻干样品；泳道2:DEAE-cellulose离子交换层析样品；泳道3:蓝色葡聚糖亲和层析样品；泳道4:疏水层析样品；泳道5:待分离样品；M:蛋白质marker。Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified PHLD fusion proteinLane 1:Lyophilized PHLD fusion protein；Lane 2:PHLD fusion protein purified by DEAE-cellulose-52 chromatography；Lane 3:Recombinant PHLD purified by Blue Sepharose 6 Fast Flow chromatography；Lane 4:PHLD fusion protein purified by Phenyl Sepharose HP Fast Flow chromatography；Lane 5:Culture supernatant；M:Protein marker.

δ-睡眠肽(DSIP)自从问世以来,关于它的研究就从未停止。虽然它在动物体内的含量极微,但是疗效确切,活性较强。在过去的10年中,DSIP主要从化学和酶合成途径获得[17,18],尽管人工合成δ-睡眠肽的技术已经很成熟,但是作为一种相对分子质量较低的九肽,其在体内的半衰期很短,因此人工合成的δ-睡眠肽并不能从根本上解决它在临床上的实际应用问题[16]。基于此,研究人员尝试采用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)构建的GST-DSIP融合蛋白在大肠杆菌中表达生产DSIP,但GST-DSIP融合蛋白在动物中的注射可引起与GST酶活性相关的生化反应[14,19]。此外,尽管重组蛋白GST-DSIP用GST亲和柱容易纯化,但是要从GST-DSIP获得完整的DSIP,需要进行复杂的处理,如利用凝血酶切割和CNBr反应从融合蛋白中切割获得靶肽[20]、去除切割的副产物等[21]。因此,利用基因工程技术通过融合蛋白进行DSIP的表达,仍然存在诸多的问题。

人血清白蛋白(HSA)是由585个氨基酸残基组成的心形结构蛋白质,包含17对二硫键和1个游离的半胱氨酸,有3个α-螺旋同源区域,每1个区域有10个螺旋,分为反平行的六螺旋亚区域和四螺旋亚区域。作为血浆中含量最丰富的蛋白质,HSA在正常人体内起着非常重要的生理作用。HSA不仅具有较大的相对分子质量,正常情况下不易透过肾小球,而且体内分布极广,具有无免疫原性、人体相容性好、组织分布广、无酶活等特性,通常被用做理想的药物融合载体[22～24]。例如,人们将人α-干扰素、生长因子以及神经生长因子与HSA进行了融合表达,所获得的产物目前都进入了临床前研究[25～27]。因此,本研究中睡眠肽与HSA融合表达所得目的产物无需酶切。此外,与人血浆中半衰期为7～8 min的游离DSIP相比,融合蛋白的血清稳定性和相对分子质量的增加将有望改善并延长体内DSIP的寿命[28]。

人类免疫缺陷病毒HIV-1的转录激活因子能够有效引导蛋白质穿透细胞膜,并保持蛋白质的生物活性[29,30]。其分子中具有蛋白质转导作用的基本结构是一个富含碱性氨基酸的多肽片段,被称为蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)[31,32]。PTD的核心序列是YGRKKRRQRRR,能够有效引导肽段或者蛋白质进入细胞,具有蛋白质传送的功能。PTD与其他蛋白质融合后不仅可快速、高效地进入细胞,而且不会影响原有蛋白质的生物学功能[33]。此外,PTD还具有携带大分子通过细胞膜和血脑屏障的功能[34～36]。因此,本研究利用PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能,设计构建了PHLD融合蛋白,该融合蛋白能够更好地透过血脑屏障,进而起到改善睡眠的作用。

本项目组在前期的研究中,构建表达了PTD-HSA-DSIP融合蛋白,显示了较好的改善睡眠的作用[16]。连接肽是融合蛋白构建中不可或缺的组成部分。在设计融合蛋白时,接入连接肽会引起小分子蛋白质漂离大分子蛋白质,从而尽可能地降低可能存在的空间位阻对活性的影响。目前,含有Gly-Ser的连接肽是相关研究中应用较多的连接肽之一。尤其是其中的(Gly4Ser)3序列,因其具有较合适的氨基酸长度,同时具有疏水性和伸展性,并能使功能蛋白质具有较好的稳定性与生物活性,已经成为了“通用连接肽”并被广泛用于融合蛋白的构建[37]。因此,本研究中设计构建含有连接肽的融合蛋白,以更好地改善融合蛋白的生物活性。

本研究通过PCR扩增技术获得PHLD基因片段,成功构建了分泌型表达PHLD融合蛋白的质粒pPIC9K/PHLD,获得了高表达的pPIC9K/PHLD毕赤酵母工程菌,并对其发酵生产PHLD融合蛋白的条件进行了考察,初步确定了目的融合蛋白生长及制备的最佳条件,而且获得了较高纯度的融合蛋白,这为进一步研究DSIP奠定了基础。