红叶石楠中功能性红色素的提取及纯化工艺研究*

易思明 范晓越 董子钰 王岁楼*

（中国药科大学工学院，江苏南京 211198）

红叶石楠为蔷薇科石楠属杂交种的统称，是常绿小乔木，其新梢和嫩叶为鲜红色，有“红衣卫士”“绿篱之王”的美称。红叶石楠的功能性色素成分之一为花色苷，是一类水溶性黄酮类物质，具有很多生理活性。目前国内对红叶石楠的研究应用大多在培养繁殖技术、园林技术等方面，鲜有对其色素研究的报道。本文对红叶石楠红色素的提取及分离纯化工艺进行初步研究，旨在为红叶石楠的综合利用及其功能性色素的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

红叶石楠叶，2017年5月采于中国药科大学宁江校园第二食堂前。

无水乙醇、丙酮、水杨酸、七水合硫酸亚铁、盐酸等，均为分析纯试剂。

1.1.2 主要仪器与设备

DF Y-500高速中药粉碎机；DZF-6050真空干燥箱；T U-1810型紫外可见分光光度计；K H-100B型超声仪；R E-5205旋转蒸发器；离心机；恒温振荡培养箱。

1.2 提取方法

将采摘的红叶石楠叶清洗后，沥干，放入烘烤箱内干燥24 h，取出后放入真空干燥箱内进一步干燥2 h。然后粉碎过筛（100目），得到红叶石楠叶粉末。称取1 g红叶石楠叶粉末，加入一定料液比的提取剂，在一定温度下超声提取一定时间，在5 000 r/min条件下离心5min，离心后取上清液即为红色素粗提液。按1.4所述方法，测定和计算提取液中花色苷总含量。

1.2.1 提取溶剂的选择

称取1 g红叶石楠叶粉末,分别以蒸馏水、丙酮、乙酸乙酯、75%乙醇（加2%盐酸）、无水乙醇（加2%盐酸） 为提取剂，料液比 1∶30（g∶mL），40 ℃下超声提取40min。

1.2.2 料液比提取选择

称取1 g红叶石楠叶粉末各1 g，以75%乙醇为提取剂，在40℃下，分别以料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g∶mL） 超声提取 40min。

1.2.3 提取时间的选择

称取1 g红叶石楠叶粉末，以75%乙醇为提取剂，料液比为1∶30（g∶mL） 在40℃条件下超声提取 20min、30min、40min、50min、60min。

1.2.4 提取温度的选择

称取1 g红叶石楠叶粉末，以75%乙醇，料液比为 1∶30（g∶mL），分别在 30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃下超声提取40min。

1.2.5 正交试验设计

在单因素试验的基础上,对乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比4个因素，采用L9（34）正交试验，以确定最优提取方案。因素水平见表1。

表1 红叶石楠红色素提取的正交试验因素及水平

1.3 纯化方法

将活化后的硅胶与洗脱剂湿法装柱，加入旋蒸后的红色素粗提液，分别用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮冲洗至流出液无色，然后用一定体积分数的乙醇溶液以一定的流速解析，得到纯化后的红叶石楠红色素溶液，在525 nm处测定吸光度，计算出纯化液中花色苷总含量。

1.3.1 吸附温度的选择

将红色素粗提液与硅胶在25℃、35℃、45℃条件下恒温振荡24 h。然后在525 nm处测得其吸光度。

1.3.2 上柱液量的选择

分别加入1mL、2mL、3mL、4mL红色素上柱液，分别用石油醚-丙酮（9∶1） 和丙酮冲洗至流出液无色，然后用50%乙醇溶液以1mL/min流速解析，测定流出液的吸光度。

1.3.3 洗脱剂浓度的选择

分别加入2mL红色素上柱液，分别用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮冲洗至流出液无色，然后分别用30%、40%、50%、60%乙醇以1mL/min流速解析，测定流出液的吸光度。

1.3.4 流速的选择

分别加入2mL红色素上柱液，分别用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮冲洗至流出液无色，然后分别用50%乙醇以 0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min流速解析，测定流出液的吸光度。

1.3.5 正交试验设计

在单因素试验基础上，采用L9（33）正交试验方法，对洗脱液乙醇浓度、上柱液体积、流速3因素做进一步优化，其因素及水平见表2。

表2 红叶石楠红色素纯化的正交试验因素及水平

1.4 测定方法

在波长525 nm处测定粗提液或者纯化液的吸光度值，然后根据Fuleki公式计算出花色苷总含量：花色苷含量 （mg/100mL） =[(A U V-V IS-MAXA1700)1-(A U V-V IS-MAX-A1700)2]×M w×DF×10 000/ε，其中：1为pH=1.0时吸光度之差，2为pH=4.5时吸光度之差，DF为稀释倍数。本试验以矢车菊-3-葡萄糖苷作为标准物，其相对分子质量M w=449.2，摩尔消光系数ε=26900。

根据所添加的红叶石楠叶片粉末的质量（mg）与稀释体积（mL），可以换算为原料石楠叶中花色苷的提取率：

石楠叶花色苷提取率（W/W,%） =（提取液花色苷含量/叶片粉末质量/稀释体积）×100%

2 结果与分析

2.1 提取试验结果

2.1.1 单因素试验结果

溶剂对红叶石楠红色素提取效果的影响见图1。

图1 溶剂对红叶石楠红色素提取效果的影响

由图1可知，不同提取剂提取效果明显不同，当提取剂为75%乙醇时，提取效果最好。

料液比对红叶石楠红色素提取效果的影响见图2。

图2 料液比对红叶石楠红色素提取效果的影响

由图2可知，不同料液比对色素提取效果影响显著，最佳料液比为1：20。

时间对红叶石楠红色素提取效果的影响见图3。

由图3可知，提取时间影响很大，最优提取时间为40min。当提取时间低于40min时，色素提取不完全，当提取时间超过40min时，可能导致其他物质溶解和扩散。

温度对红叶石楠红色素提取效果的影响见图4。

图3 时间对红叶石楠红色素提取效果的影响

图4 温度对红叶石楠红色素提取效果的影响

由图4可知，最优提取温度为50℃。当温度过低时，色素提取不完全，但温度过高时，可能导致色素破坏。

2.1.2 正交试验结果

红叶石楠红色素提取的正交实验结果见表3。

表3 红叶石楠红色素提取的正交实验结果

由表3可以看出，正交试验中4个因素对红叶石楠红色素提取都有一定影响。比较极差R大小，可知各因素影响次序为：料液比＞提取时间＞乙醇浓度＞提取温度；比较同一因素不同水平的结果，得知最优条件组合为A1B2C3D2，按此最优理论组合进行验证试验，结果与正交试验中2号结果接近，因此选定2号的试验条件A1B2C2D2为最佳提取方案：即提取溶剂为50%乙醇，料液比为1∶20（g∶mL），提取温度为50℃，提取为40min，此时提取液中花色苷含量可达4.21mg/100mL，换算成叶片中总花色苷提取率（%） 为0.084 2。

2.2 纯化试验结果

2.2.1 单因素试验结果

温度对硅胶吸附性能的影响见图5。

图5 温度对硅胶吸附性能的影响

由图5可见，静态吸附时温度对硅胶性能影响不大，为了方便操作，选择在室温下进行。

上柱液量对红叶石楠红色素纯化效果的影响见图6。

图6 上柱液量对红叶石楠红色素纯化效果的影响

由图6可见，当红色素上柱液体积为3mL时，纯化后的红色素吸光度最大。随着上柱液体积增大，吸光度变化不明显，说明在红色素上柱液体积为3mL时，硅胶吸附达到饱和，吸附剂不再吸附样液。

洗脱剂浓度对红叶石楠红色素纯化效果的影响见图7。

图7 洗脱剂浓度对红叶石楠红色素纯化效果的影响

由图7可见，当以50%乙醇作为洗脱剂时所测得的吸光度最大。

流速对红叶石楠红色素纯化效果的影响见图8。

图8 流速对红叶石楠红色素纯化效果的影响

由图8可见，随着流速的增加，红色素的吸光度逐渐下降。

2.2.2 正交试验结果

红叶石楠红色素纯化的正交实验结果见表4。

表4 红色素纯化的正交试验结果

由表4可以看出，正交试验中3个因素对红叶石楠红色素的纯化效果都有一定的影响。比较极差R大小，可知各因素影响次序为：洗脱液浓度＞流速＞上柱液体积。比较同一因素不同水平的结果，得知最优条件组合为A2B1C2，此最优理论组合正好与正交试验中4号试验的条件组合一致。因此，选定A2B1C2为红叶石楠红色素纯化的最佳工艺参数组合，即40%乙醇作洗脱剂，上柱液体积3mL，以1mL/min流速进行洗脱。

由以上最佳条件的试验结果可以得出：纯化倍数=(1.08/4.21)×10=2.57，其中1.08mg/100mL为纯化后花色苷含量最大值，4.21mg/100mL为提取液花色苷含量最大值，10为稀释倍数。

3 结论

红叶石楠红色素提取的最佳条件为：采用50%乙醇为提取剂，料液比1∶20（g∶mL），在50℃下提取40min，花色苷提取率可达0.084 2%。

红色素粗提液纯化的最佳工艺条件为：在室温下，以硅胶作吸附剂，40%乙醇作洗脱剂，加样量为3mL，以1mL/min流速进行洗脱，纯化倍数可达2.57。

试验结果表明，从红叶石楠提取制备红色素是可行性的，其提取与纯化工艺条件值得进一步研究优化。