草鱼内脏蛋白的水解工艺研究

褚晨艳颜子晨王 缘刘 言杨 澜陈 军（

1苏州世标检测技术有限公司，河南郑州215104） （2淮阴工学院，江苏淮安223003）

随着淡水鱼产量的增加和淡水鱼加工制品的日益开发和生产，大量的淡水鱼加工废弃物有待处理。近年来除了对鱼头、鱼尾等利用较多外，蛋白质和脂肪含量较高的内脏却没有得到合理有效的利用，这不仅造成了资源的浪费，而且污染了环境。鱼内脏中脂肪、蛋白质、氨基酸及矿物质含量丰富。利用鱼内脏来开发淡水鱼油、动物饲料蛋白强化剂的前景广阔。淡水鱼内脏蛋白的氨基酸组成模式比较平衡，鱼蛋白量大而质优，有着巨大的开发潜力，是蛋白生产的良好来源。因此，对淡水鱼下脚料资源—鱼内脏综合利用的研究具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼内脏。

胰蛋白酶、牛血清蛋白、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸、考马斯亮蓝、氯化钠、硫酸钾、硫酸铜、甲基红、亚甲基蓝、无水乙醇等。

1.2 仪器与设备

电子天平；电热恒温鼓风干燥箱；电热恒温培养箱；电热恒温水浴锅；精密酸度计；离心机（Anke）；电子式可调万用电炉；分光光度计。

1.3 试验方法

1.3.1 草鱼内脏蛋白水解工艺流程

草鱼内脏→去杂→洗净→沥干→匀浆→脱脂→烘干→酶解→离心

1.3.2 草鱼内脏主要成分分析方法

蛋白质含量：凯氏（Micro-kjeldahl）定氮法。

粗脂肪：索氏提取法（Soxhlet extractor method）。

氨基态氮测定：考马斯亮蓝法（coomassie blue staining）。

1.3.3 草鱼内脏蛋白水解单因素试验

准确称取经脱脂烘干的内脏于三角瓶中，加入胰蛋白酶液进行酶解，将酶解液3 000 r/min离心30 min，测定上清液中蛋白含量，计算水解度（DH）。分别以酶解温度、加酶量、酶解时间、pH、液料比为变量做单因素试验，每组试验做3个平行。

1.3.4 草鱼内脏蛋白水解正交试验

根据单因素试验结果，选择3个重要的影响因素为自变量，每个因素设置3个水平，以水解度为指标，研究草鱼内脏蛋白水解过程中各个因素对水解效果的影响。

2 结果与分析

2.1 草鱼内脏基本成分分析

草鱼内脏基本成分表见表1。

表1 草鱼内脏基本成分表

不同季节草鱼内脏中的脂肪和蛋白质含量有所差异，但总体变化不大。由表1可知，草鱼内脏中的脂肪含量很高。试验结果显示，草鱼内脏中含有大量粗脂肪和粗蛋白，分别达25.81%和6.99%。

干燥脱脂后草鱼内脏的蛋白含量为62.68%，考马斯亮蓝比色法和凯氏定氮法测定结果的比值即水解度。

2.2 草鱼内脏蛋白水解的单因素试验

2.2.1 酶解温度对鱼内脏蛋白水解度的影响

草鱼内脏蛋白在不同温度下水解，温度对鱼内脏蛋白水解度的影响结果如图1所示。

图1 酶解温度对鱼内脏蛋白水解度的影响

由图1可知，当温度为30℃时，其酶解液水解度25.13%；当酶解温度上升至35℃时，水解度呈现上升的趋势，并达到最大值；当超过35℃以后，水解度曲线呈现缓慢下降趋势。因此选择最佳的酶解温度为35℃。

2.2.2 酶添加量对鱼内脏蛋白水解度的影响

酶添加量对鱼内脏蛋白水解度的影响结果见图2。

由图2可知，加酶量较低时草鱼内脏蛋白水解度较低，随着加酶量的增加水解度也逐渐增大，当加酶量达到25U/mL时，水解度达到最大值，再增加酶量，水解度增加趋势不明显。这是因为当酶浓度相对于底物浓度较高的情况下，反应速率开始由底物浓度控制，所以继续增加酶的用量，水解度的变化不明显。为了使鱼内脏蛋白水解较彻底，适当控制水解出的蛋白含量，因此，加酶量选25U/mL。

2.2.3 酶解时间对鱼内脏蛋白水解的影响

酶解时间对草鱼内脏蛋白酶解液水解度的影响如图3所示。

图3 酶解时间对鱼内脏蛋白水解度的影响

酶的催化速度受到产物的影响，反应初期，产物的抑制作用小，随着时间的延长，产物的抑制作用增加，酶活力逐渐下降。由图3可知，酶解时间为1 h时，水解度较低，此时反应不完全，底物未能够被完全水解；当酶解时间延长至3 h时，水解度达到最高值，为35.99%；当酶解时间超过3 h后，产物的抑制作用增加，水解度呈下降趋势，但与3 h时的水解度相比还是保持在较高水平。

2.2.4 pH值对鱼内脏蛋白水解的影响

酶活力对其环境pH值十分敏感，只有在特定的pH值条件下，酶分子与底物蛋白分子才会结合更快更好，酶解速度也较快。pH对草鱼内脏蛋白酶解液的水解度影响如图4所示。

图4 pH值对鱼内脏蛋白水解度的影响

由图4可知，当pH为3时，水解度较小，为15.57%；pH为4、5、6时，水解度呈上升趋势，这说明胰蛋白酶在酸性条件下活性较低；当pH为7时，草鱼内脏蛋白酶解液水解度最高，此时胰蛋白酶活性最高。因此，选择pH值为7较为合适。

2.2.5 液料比对鱼内脏蛋白水解的影响

液料比对鱼内脏蛋白水解度的影响结果见图5。

图5 液料比值对水解蛋白含量影响

由图5可知，当液料比较小时，草鱼内脏蛋白酶解液水解出的蛋白含量较低，这是由于底物浓度过大，胰蛋白酶不能与底物充分接触，从而使其不能充分反应，增加液料比，底物浓度降低，酶解液水解出的蛋白含量增加，当液料比增加到40时，水解度达到最大为36.87%，继续增加液料比，水解度不再增加甚至变小，因为底物浓度过低，酶无法与底物充分结合，影响其水解，随着产物的抑制作用逐渐增强，水解度会变得更低。因此，选择40为最佳液料比。

2.3 草鱼内脏蛋白的水解正交实验优化

根据单因素试验结果可知，时间和液料比对鱼内脏蛋白水解度的影响不大，因此选取酶添加量、水解温度、pH值3个因素，采用L9（33）正交试验对草鱼内脏蛋白水解工艺条件进行优化。正交试验因素水平设计和结果分别见表2、表3。

表2 正交试验因素和水平设计

表3 正交试验方案及结果分析

由分析结果可以看出，温度对于水解度的影响最为显著，pH值对水解度的影响较小，采用软件对上述测定指标分析，得出酶解最优条件为：酶解温度35℃，酶添加量25 U/mL，酶解pH8.0，液料比40，酶解时间3 h，草鱼内脏蛋白酶解液的水解效果最好，可被水解的蛋白占鱼内脏总蛋白的37.87%。

3 存在及待解决的问题

本试验中，草鱼内脏蛋白的最优水解度仅为37.87%，还有提高的可能性，并且由于内脏前期较难处理，损失较大，且内脏中会滞留一定的肠道内容物，它会抑制酶的活性，影响蛋白质的水解，因此如果要提高草鱼内脏蛋白的水解度，前期处理非常重要，要将肠道内容物尽可能地处理干净，并尽力减小损失，使处理后的内脏样品符合其原有的比例，还要将内脏样品尽量粉碎彻底，使得在反应时底物与酶可以充分并均匀的接触。本试验过程中没能很好地解决鱼肠道内容物的处理问题，导致试验结果稍有偏差。因此对草鱼内脏蛋白的水解工艺研究还可以进一步完善，对所得水解产物的分析及利用还有待于进一步研究。