白耙齿菌固体发酵物对高尿酸血症及痛风性关节炎的治疗作用

黄 静，李 昂，刘宇光，张执刚，白忠秀，杜大军，王淑敏

(1.长春中医药大学，长春 130117；2.沛芝堂(辽宁)科技发展有限公司，沈阳 110001)

痛风是嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少而致血尿酸水平升高，尿酸盐晶体沉积于组织或器官并引起组织损伤的一组临床综合征，主要表现为反复发作性关节红、肿、热、痛与功能障碍，甚至导致关节畸形、肾石病及尿酸性肾病等。目前临床常用的药物有秋水仙碱、别嘌呤醇、糖皮质激素和免疫抑制剂等。这类药物常会引起胃肠道不良反应，对骨髓有直接抑制作用，且复发率高[1-4]。白耙齿菌(Irpexlacteus)属于多孔菌目(Polyporales)皱孔菌科(Meruliaceae)耙齿菌属(Irpex)的一种药用真菌，生于阔叶树的枯立木、枯枝上，具有很好的抗菌、消炎和利尿等功效，民间常用其治疗肾小球肾炎[5]。白耙齿菌发酵物已被开发成中成药益肾康胶囊，用于慢性肾小球肾炎，属下焦湿热证。在临床应用的过程中，有一些痛风性肾病患者服用后，关节疼痛也得到缓解。本实验建立小鼠高尿酸血症和大鼠痛风性关节炎模型，研究白耙齿菌固体发酵产物对高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗作用及其机制，为白耙齿菌新的临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 FLUOstar Omega全自动多功能酶标仪(广州伯齐科技有限公司)；AUY220精密电子天平(日本岛津公司)；TDL5M台式低速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)。

1.2试药 酵母膏(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20110321)。白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)ELISA试剂盒以及前列腺素E2(PGE2)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脱氨酶(ADA)、血肌酐(Scr)和尿酸(UA)检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；白耙齿菌固体发酵产物(双向固体发酵所得)由长春中医药大学真菌研究室提供；尿酸钠(Sigma公司)；秋水仙碱片(通化百信药业有限公司，批号140109)；腺嘌呤(天津力生制药股份有限公司，批号20140611)；盐酸乙胺丁醇(沈阳红旗制药有限公司，批号1407341)；别嘌呤醇(世贸天阶制药江苏有限责任公司，批号20141217)。

1.3动物 健康SD大鼠50只，雄性，清洁级，体质量180～250 g，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK(吉)-2011-0004。健康昆明种小鼠50只，雄性，清洁级，体质量18～22 g，由长春生物制品研究有限责任公司提供，合格证号SCXK(吉)2011-0003。动物饲养观察环境：温度24～25 ℃，湿度60%±10%。

2 方法

2.1对小鼠高尿酸血症的影响 取小鼠50只，雄性，随机分成空白组、模型组、别嘌呤醇组(40 mg·kg-1)及白耙齿菌固体发酵产物高、低剂量组(1和0.5 g·kg-1)，每组10只。各组小鼠适应1周后，以体质量每10 g 0.2 mL连续灌胃给药21 d。给药1周后，除空白组外，其余各组均灌胃造模药(腺嘌呤100 mg·kg-1、盐酸乙胺丁醇250 mg·kg-1、酵母膏15 g·kg-1)，连续造模14 d，造高尿酸血症模型[6]，空白组给予等体积生理盐水。实验第21天，小鼠禁食24 h，眼球取血，以3 000 r·min-1离心15 min，取血清备用。小鼠脱颈处死，摘取肝脏，冻存备用。将肝脏组织制成质量分数为10%的组织匀浆，以2 500 r·min-1离心10 min，取上清液，测定肝脏中XOD及ADA活性。取血清，测定其血清肌酐(Scr)和尿酸(UA)的含量，测定方法按照试剂盒说明书进行。

2.2对大鼠痛风性关节炎的影响 将大鼠随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组(秋水仙碱 40 mg·kg-1)、白耙齿菌固体发酵物高剂量组(1 g·kg-1)和白耙齿菌固体发酵物低剂量组(0.5 g·kg-1)5组，每组10只。药物均溶于生理盐水中给药，各组大鼠均连续灌胃14 d。

除空白对照组外，其余各组大鼠右后肢均用乙醇消毒，以无菌操作的方法，将体积分数为5%的尿酸钠混悬液0.2 mL，注射入大鼠右后肢内踝的胫附关节腔内，每只大鼠仅注射1次[7-8]。分别于造模后6，12，24，30，36，48，54，60和72 h测定大鼠踝关节肿胀度；给药14 d后，眼眶取血3～4 mL，以3 000 r·min-14 ℃离心10 min，取上清液，ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2的水平，测定方法严格按照试剂盒说明书进行。

踝关节组织在体积分数为10%的中性福尔马林中固定后，脱钙，石蜡包埋，切成4 μm的厚度，二甲苯脱蜡，梯度乙醇漂洗，苏木精和伊红染色(H&E)，在200倍光镜下观察。

3 结果

3.1对小鼠高尿酸血症的治疗作用 白耙齿菌固体发酵物能显著降低高尿酸血症小鼠血酸与血肌酐的含量以及小鼠肝脏XOD与ADA的活性。见表1。

3.2对大鼠痛风性关节炎的治疗作用 白耙齿菌固体发酵物可显著降低大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平，见表2。

表1白耙齿菌固体发酵物对高尿酸血症小鼠Scr、UA、XOD和ADA的影响

组别剂量/g·kg-1Scr/U·mg-1protUA/mg·L-1XOD/U·g-1protADA/U·mg-1prot空白组-34.06±6.3143.75±3.8523.98±4.838.90±1.82模型组-36.16±9.5556.41±3.85▲34.31±7.15▲▲14.20±4.03▲▲别嘌呤醇组0.0416.81±3.82**38.96±5.91**18.50±4.65**9.45±5.21*白耙齿菌固体发酵物高剂量组1.005.80±2.44**41.56±4.74*19.42±4.47**5.80±2.44**白耙齿菌固体发酵物低剂量组0.507.23±1.81**42.86±2.78*17.15±4.89**7.23±1.81**

注：与空白组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。-表示未给药。

表2白耙齿菌固体发酵物对痛风性关节炎大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的影响

Tab.2 Effects of solid fermentation products ofIrpexlacteuson IL-1β，IL-6，TNF-αand PGE2in mice with gouty arthritis

组别剂量/g·kg-1IL-1β/ng·L-1 IL-6/ng·L-1TNF-α/ng·L-1PGE2/ng·L-1空白组-1.91±0.3672.20±17.74215.90±36.40478.34±47.57模型组-2.24±0.19▲99.89±15.89▲▲297.03±33.42▲▲533.83±42.10▲▲秋水仙碱组0.042.02±0.16*95.28±22.05259.38±18.34*472.19±63.98*白耙齿菌固体发酵物高剂量组1.001.97±0.30*51.50±23.00**154.81±40.63**426.77±57.33**白耙齿菌固体发酵物低剂量组0.502.01±0.47*79.26±22.65*182.30±56.61**435.27±80.60**

注：与空白组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。-表示未给药。

病理学检查结果见图1。由图1可知，空白组关节表面被覆薄层透明软骨，细胞排列整齐、无变性、坏死，关节腔清晰。关节囊由结缔组织构成，表面覆有1～4层滑膜细胞，细胞无变性、坏死，无增生。模型组可见明显的滑膜组织充血，有血管翳或痛风结晶，中度炎症细胞浸润。秋水仙碱组滑膜组织轻度充血、伴轻度炎细胞浸润。白耙齿菌固体发酵物高剂量组有1只滑膜组织中度充血、滑膜细胞轻度被侵蚀，其他样本无明显病变。白耙齿菌固体发酵物低剂量组有1只滑膜组织中度充血、局部中度微增生，其他样本无明显病变。

图1大鼠踝关节病理学检查结果

A.空白组；B.模型组；C.秋水仙碱(40 mg·kg-1)；D.白耙齿菌固体发酵物低剂量组(0.5 g·kg-1)E.白耙齿菌固体发酵物高剂量组(1 g·kg-1)。

Fig.1 Results of histopathological examination of ankle joint of rats

A.blank group；B.model group；C.colchicine(40 mg·kg-1)；D.drug low dose group of solid fermentation product ofIrpexlactues(0.5 g·kg-1)；E.drug high dose group of solid fermentation product ofIrpexlactues(1 g·kg-1).

4 讨论

实验结果表明，高尿酸血症模型组小鼠血清尿酸(UA)水平与正常组小鼠比较显著升高(P<0.01)，证明造模成功。高尿酸血症的形成主要是尿酸生成过多或排泄减少，尿酸由内源性和外源性2种途径产生，外源性尿酸来源于食物，内源性尿酸来源于核苷酸分解代谢。高嘌呤膳食和体内核酸的大量分解均可导致血尿酸升高，内源性代谢紊乱较外源性因素更重要[9-10]。嘌呤中的次黄嘌呤和黄嘌呤是尿酸形成的直接前体，在黄嘌呤氧化酶(XOD)的作用下，次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，黄嘌呤氧化为尿酸[11]。XOD是嘌呤核苷代谢途径的限速酶，主要存在于肝脏中，是调控尿酸生成的最终环节，可连续氧化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸，直接调控体内尿酸水平[12]。腺苷脱氨酶(ADA)是腺苷酸分解代谢的重要酶之一，ADA活性的增加会增加机体内黄嘌呤与次黄嘌呤的产生量并引起细胞毒性[13]，而其活性降低则能提高机体的抗炎能力[14-15]。白耙齿菌发酵物和别嘌呤醇均能明显降低高尿酸小鼠XOD和ADA水平，其机制可能是通过抑制体内XOD和ADA活性从而降低体内尿酸的生成。

血清肌酐(Scr)是肾功能的重要指标，实验模型组血肌酐与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明高尿酸小鼠模型未出现肾功能严重损伤。但阳性药别嘌呤醇和白耙齿发酵物各组血肌酐水平均明显下降(P<0.05)，证明白耙齿菌发酵物具有保护肾小球和肾小管功能受损的作用。

急性痛风性关节炎 (AGA) 是痛风典型的表现形式，关节损伤的病理过程与滑膜细胞、软骨细胞、巨噬细胞等产生的IL-1β、TNF-α和IL-6等多种细胞因子密切相关。受累关节由于 TNF-α、IL-1β、IL-6和前列腺素E2(PGE2)等炎症因子和疼痛因子产生的增加，导致关节软骨炎症损伤，出现红、肿、热、痛。TNF-α是关节软骨破坏最重要的炎症介质之一，炎症细胞产生和释放 PGE2，能引起滑膜软骨细胞及破骨细胞减少蛋白多糖的合成，加速其降解，诱导软骨基质崩解，加速软骨吸收和破坏，导致关节畸形及功能障碍[16-17]。ELISA 检测结果显示，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平明显高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.05)，证明造模成功。白耙齿菌发酵物治疗后，AGA大鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平显著降低，表明白耙齿菌发酵物降低以上炎症因子水平可能是其发挥 AGA 治疗作用的机制，与秋水仙碱降低 IL-1β、TNF-α和PGE2水平发挥抗炎止痛作用相似。秋水仙碱组治疗IL-6水平降低不明显，提示白耙齿菌发酵物在抗炎止痛方面与秋水仙碱抗炎作用不完全一致。

研究报道[18]，机体内的 TNF-α和IL-1β2种细胞因子能够诱导相互影响，共同参与痛风性关节炎的发病过程。降低痛风性关节炎IL-1β和TNF-α的水平，可能会终止炎性细胞因子的恶性循环，是痛风性关节炎有效治疗的作用靶点。本实验研究白耙齿菌发酵物能降低血清 TNF-α和IL-1β的含量，证明白耙齿菌能够抑制痛风性关节炎的核心炎症因子TNF-α和IL-1β的合成，这可能也是其发挥抗炎作用，治疗痛风性关节炎的重要机制之一。

病理学检查结果表明，模型组滑膜组织充血明显，有血管翳或痛风结晶，中度炎症细胞浸润。秋水仙碱组和白耙齿菌发酵物药物组除个别动物有轻微组织损伤外，基本恢复正常，证明给药治疗各组对AGA具有确切的治疗效果。

综上所述，白耙齿菌固体发酵物能显著降低高尿酸血症小鼠体内的XOD及ADA的活性，降低血清肌酐和尿酸的水平。同时，由炎症因子及病理切片结果可知，白耙齿菌固体发酵产物对痛风的治疗效果显著，而白耙齿菌固体发酵产物简单易得，具有进一步研究开发的价值。