肝癌组织中血管内皮生长因子的表达水平及影响因素分析

范秀平，张春燕，李晓辉

(成都医学院第一附属医院消化内科，四川 成都 610500)

肝癌是临床常见恶性肿瘤，起病隐匿，进展速度快，恶性程度高，术后复发、转移率高，预后差[1]。且肝癌属典型多血管肿瘤，血管生成在肝癌发病及进展中有重要作用，同时也是引起肝癌转移、复发的关键原因。血管内皮生长因子(VEGF)与肝癌血管生成相关度较高，可促进细胞增殖，引起内皮细胞分化，提升血管通透性，提升蛋白水解酶活性，促进肿瘤新生血管生成[2]。临床研究发现，癌细胞VEGF信号转导在肿瘤细胞生成、迁移及侵袭过程中有重要作用[3]。早期研究发现，乳腺癌、结直肠癌患者癌组织VEGF阳性率较高[4]，但目前对肝癌患者VEGF表达情况的变化及其机制少见报道。本文探讨肝癌癌组织VEGF表达情况及其影响因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料2015年1月至2017年5月我院接受手术治疗的80例肝癌患者，均经病理证实为肝癌，术前未接受放化疗及介入治疗。其中男51例，女39例；年龄39～79岁[(62.4±5.7)岁]；分化程度：高分化20例，中分化35例，低分化25例；肝癌TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期44例，Ⅲ期27例；肝功能Child-Pugh分级：A级45例，B级35例；存在淋巴结转移34例。并收集其中40例距肝癌组织2 cm以上癌旁组织标本，均经病理证实无肿瘤细胞浸润，未见增生性病变。

1.2主要试剂与仪器鼠抗人VEGF免疫组化单克隆抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(均购自福州迈新生物技术开发有限公司)，四元羧酸乙二胺四乙酸(EDTA)组织抗原修复液(购自北京金桥生物科技有限公司)，免疫组化试剂盒(辣根过氧化物酶标记工作液、生物素标记通用型免疫蛋白G(IgG))(上海新肽生物科技有限公司)；Nikon YS100型光学显微镜(日本Nikon公司)，11-2R型电热恒温水浴箱(南京医疗器械厂)，RM2145型切片机(德国Leica公司)，电热恒温培养箱(上海医疗器械三公司)，TS-12C型自动脱水机(湖北电子仪器厂)，Z323K高速冷冻离心机(德国Hermle公司)。

1.3方法采用免疫组化法测定肝癌癌组织、癌旁组织VEGF表达。石蜡标本连续切片，厚度4 μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗涤3次×3 min，3%过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次×3 min，EDTA高压修复2 min，室温冷却，PBS冲洗3次×3 min，动物血清封闭，室温孵育10 min，滴入鼠抗人VEGF单克隆抗体，4 ℃低温过夜，PBS冲洗3次×3 min，滴生物素标记IgG，室温孵育15 min，PBS冲洗3次×3 min，滴入DAB显色液显色，返蓝10 min，蒸馏水冲洗，苏木素复染，清水冲洗，酒精分化，返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察染色情况。

1.4判断标准VEGF阳性表达定位于细胞膜或细胞浆内，呈棕褐色颗粒。每张切片均选取5个高倍视野进行观察，应用半定量积分法评定染色结果，着色强度：无着色为0分；黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞比例：低于5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。阳性细胞比例评分×着色强度评分为最终评分，阴性为0分；弱阳性为1～4分；中度阳性为5～8分；强阳性为9～12分。

1.5统计学方法采用SPSS 19.0软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验，相关分析采用Pearson相关性分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肝癌组织与癌旁组织VEGF表达情况比较肝癌组织VEGF表达阳性率高于癌旁组织，且中度阳性、强阳性比例高于癌旁组织，弱阳性比例低于癌旁组织(P< 0.05)，见表1。肝癌组织VEGF阳性产物为棕褐色、淡黄色颗粒，主要表达于细胞浆内，呈弥散分布，在肝癌组织肝细胞索与血管内皮细胞内间隙肝窦细胞内呈弱表达，癌组织VEGF阳性分布及着色程度不均(图1a)；癌旁组织VEFG表达水平较低，着色浅(图1b)。

表1 肝癌组织与癌旁组织VEGF表达情况比较 [n(%)]

图1 组织VEGF表达(HE×100) a:肺癌组织；b.癌旁组织

2.2不同临床病理参数肝癌组织VEGF表达情况比较不同分化程度、不同TNM分期、不同肝功能分级、是否合并淋巴结转移患者VEGF阳性率比较差异均有统计学意义(P< 0.05)，肿瘤低分化患者VEGF阳性率高于高分化者，高TNM分期、肝功能分级及合并淋巴结转移的肝癌患者癌组织VEGF阳性率较高(P< 0.05)，见表2。

2.3肝癌组织VEGF表达与临床病理参数的关系肝癌组织VEGF表达与肿瘤分化程度呈负相关，与TNM分期、肝功能分级、淋巴结转移呈正相关，与淋巴结转移相关度最高(P< 0.05)，见表3。

表2 不同临床病理参数肝癌患者癌组织VEGF表达情况比较[n(%)]

表3 肝癌癌组织VEGF表达与临床病理参数的关系

3 讨论

肝癌起病隐匿，大部分患者发病初期均无特异性症状表现，确诊时已进展至中晚期，部分发生淋巴结转移或远处转移，手术根治效果差，术后复发率高[5，6]。而浸润及转移为恶性肿瘤的共同特点，是影响其预后的关键因素。而肿瘤浸润及转移过程通常受多因素影响[7]，明确其相关影响因素则可为患者预后改善奠定基础。VEGF系特异性作用于血管内皮细胞的多功能的蛋白，可选择性作用于血管内皮细胞膜络氨酸激酶受体，加速内皮细胞有丝分裂，促进内皮细胞增殖及微血管形成，加快内皮细胞、单核细胞迁移速度，上调间质胶原酶、蛋白水解酶表达[8]。早期研究发现，卵巢癌、结肠癌、非小细胞肺癌患者均可见VEGF表达上调，提示VEGF在恶性肿瘤发病过程中有重要作用[9，10]。有学者发现，人肝细胞肝癌中VEGF及血管生成素均可促进肿瘤血管生成及肿瘤进展[11]。本研究发现，肝癌组织VEGF表达阳性率明显高于癌旁组织，与熊建宁等[12]结论相符，提示肝癌发病过程中VEGF发挥重要的作用。血管生成是肿瘤生长、侵袭及转移的基础，血管生成可为肿瘤生长及增殖提供必要的营养支持，为癌细胞提供充足的血液供应，同时是促进肿瘤细胞扩散的重要途径，可导致癌细胞血管渗透，促进其进入血循环，发生血行转移。且VEGF可降解血管内皮细胞基质，削弱血管屏障作用，加重血管基底膜缺损，促进肿瘤转移[13]。而肝癌为富血供肿瘤，其生长、增殖及转移均有赖于VEGF的调控，细胞表面VEGF表达上调，肿瘤血管生成对肝癌生物学行为及侵袭性、增殖活跃性均产生重要的影响[14]。

本研究还发现，肝癌组织VEGF表达水平受肿瘤分化程度、肝癌TNM分期、肝功能分期及淋巴结转移的影响，提示VEGF表达与肝癌生物学行为存在密切关联，一般肿瘤分化程度越低，提示恶性程度高，肿瘤新生血管生成多，预后差。而肝癌TNM分期及肝功能分级越高的患者肝功能受损较为严重，肿瘤侵袭性越强，癌细胞生长速度快，可引起局部缺氧，导致癌细胞分泌大量VEGF，促进新生血管生成，造成癌细胞侵袭及转移。此外，肝癌淋巴结转移与淋巴管结构存在关联，淋巴管管腔大，管壁薄，且不规则，当毛细淋巴外周组织受肿瘤侵犯时，淋巴管通透性提升，渗出增加，外周组织压力上升，开放内皮细胞连接，导致癌细胞进入淋巴管，并向管腔内聚集，沿低阻区域蔓延、浸润，导致淋巴结受累[15]。而VEGF主要表达于淋巴管内皮细胞内，对淋巴结管内皮细胞有较强的趋化作用，VEGF过度表达可促进内皮细胞增殖及淋巴管生成，直接引起肿瘤侵袭淋巴结并发生转移[16]。此外，VEGF可于肝癌细胞膜受体结合，促进肿瘤增殖；同时其作用于癌细胞后可降低其间质粘附性，促使癌栓分离及脱落，导致肿瘤转移。另外，VEGF可提升肿瘤血管通透性，促进血管内皮细胞释放大量基质降解蛋白酶，降解细胞外基质，提升血管通透性，促进肝癌侵袭、转移。

综上，肝癌组织VEGF表达阳性率高，且其表达水平受病理因素的影响，包括肿瘤分化程度、TNM分期、肝功能分级及淋巴结转移等，在肝癌侵袭及转移过程中有重要作用。