HPLC对酸茶中儿茶素及游离氨基酸组分含量的测定

肖秀丹　黄友谊　钟家成

摘要：采用高效液相色谱法对腌制型酸茶中的儿茶素组分及游离氨基酸组分进行了研究。结果表明，酸茶中儿茶素单体的相对含量变化与其他发酵类茶产品中的儿茶素单体变化不一样，酸茶中EC、EGC、ECG、EGCG、GCG、GA发酵后最高含量分别为24.29、72.78、15.8、41.04、7.82、25.71 g/kg。经过发酵，酯型儿茶素含量下降，非酯型儿茶素含量上升，GA含量大幅增加。检测结果显示，酸茶中的游离氨基酸组分和含量发生了不同程度的变化，18种氨基酸中绝大部分种类含量增加，7种人体必需氨基酸含量均增加，2种鲜味氨基酸含量也增加。通过对酸茶的部分内含成分进行分析，希望能为酸茶产品的开发提供参考。

关键词：HPLC；酸茶；儿茶素；游离氨基酸

中图分类号：O657.7+2；S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）09-0092-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.09.022

HPLC Determination of Catechins and Free Amino Acids Components in Acid Tea

XIAO Xiu-dan1，HUANG You-yi2，ZHONG Jia-cheng1，HUANG Yan-zheng1

（1.Department of Technology Promotion Yiling Distric/Yichang Comprehensive ExperimentalStation of China Agriculture Research System，Yichang 443100，Hubei，China；2.Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，and Tea Science Department of Horticulture and Forestry Science College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： The catechins and free amino acids of acid tea by anaerobic solid-state fermentation were determined by using HPLC. The results show that the change of relative contents of catechins in acid tea is different from that in other fermented tea products. The contents of EC，EGC，ECG，EGCG，GCG and GA in acid tea were 24.29 g/kg，72.78 g/kg，15.8 g/kg，41.04 g/kg，7.82 g/kg，25.71 g/kg respectively. By anaerobic solid-state fermentation，the content of ester catechins decreased， the content of non esterified catechins increased and the content of GA increased significantly. The result showed the components and contents of free amino acids have changed differently. The contents of 18 kinds of amino acids and 7 essential amino acids increased. The content of 2 flavor amino acids also increased. Based on the analysis of some components of acid tea，the paper want to offer some help for the development of acid tea products.

Key words： HPLC； acid tea by anaerobic solid-state fermentation； catechins； free amino acids

酸茶作为一种独特的茶产品，一直以来在中国、泰国和缅甸等国家被人们食用或饮用。在云南少数民族如德昂族、布朗族等地区，具有酸味和苦涩味的酸茶作为一种民族特色食品而深受当地群众喜爱，是一种独特又重要的食品，被他们视为上等菜肴，只有遇到喜庆之事或者有客人拜访时才会将之取出招待客人。酸茶是這些民族特有的民俗文化的重要组成部分[1，2]。

酸茶作为一种微生物发酵类的茶产品至今未引起广泛关注，制约其发展的主要原因是发酵技术和品质形成机理方面的科学研究较少[3，4]。本研究以夏秋茶树鲜叶为原料，利用自然接种方式腌制茶叶，通过室温自然处理发酵和在超净工作台处理无菌发酵两种不同发酵方式制得酸茶，对酸茶的儿茶素组分和氨基酸组分进行了详细的比较分析，从而得出酸茶中茶叶特征成分的变化趋势，为酸茶的生产制作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

所有腌制酸茶的原料均为一芽三、四叶的茶鲜叶，于2010年6月采自华中农业大学茶学教学实习基地。

1.2 仪器与设备

HH-6型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；DHG-9246型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；AW220型托盘电子分析天平（日本京都岛津有限公司）；FZ102型巨轮牌植物粉碎机（河北马华市齐家务科学仪器厂）；HD-1360型超净工作台（北京冬联哈尔仪器有限公司）；Waters 600双泵高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）；GC-MS QP-2010气相色谱质谱联用仪（日本京都岛津仪器有限公司）。

1.3 酸茶制备

鲜叶采摘后按照以下步骤进行腌制处理，待发酵结束后取样审评并进行理化成分分析。工艺流程：鲜叶→水潦杀青→沥水→盐渍→装瓶→压实密封→厌氧发酵→成品。自然处理样在空气无污染的室内进行，无菌处理样将水潦杀青后的茶叶放进超净工作台里进行后续步骤，将全部装瓶完毕的样品放在25～28 ℃室内进行发酵。

1.4 色谱条件

1.4.1 酸茶儿茶素成分的检测 Waters 600双泵高效液相色谱仪、Waters empower色谱管理系统、Waters 2489 紫外检测器；色谱柱： Phenomenex Gemini C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），洗脱柱温20 ℃，进样量5 μL，流速1 mL/min，检测波长278 nm。A相为0.2%的乙酸水溶液，B相为纯乙腈。梯度洗脱，梯度见表1。茶样前处理：称取1.5 g茶，加125 mL沸水，沸水浴浸提45 min，趁热抽滤，最后定容至250 mL，0.45 μm水相滤头过滤，收集2 mL滤液备用。所有标品均购自Sigma-AEDRICH CHEMIE CO.LTD，甲醇、乙腈和乙酸均购自TEDIA COMPANY.INC（纯度均为HPLC/SPECTRO）。

1.4.2 酸茶氨基酸组分的检测 Waters 600双泵高效液相色谱仪、Waters Empower色谱管理系统、Waters 2475荧光检测器；检测器设置：激发波长250 nm，发射波长395 nm。色谱柱：高效Nova-PakTM C18 柱（150 mm×4.6 mm，4 μm），洗脱柱温37 ℃，进样量5 μL，流速1 mL/min。A相为购于Waters公司的洗脱液A，稀释10倍而成，B相为纯乙腈，C相为超纯水。梯度洗脱，梯度见表2。茶样前处理：称取1.5 g茶，加125 mL沸水，沸水浴浸提45 min，趁热抽滤，最后定容至250 mL，0.45 μm水相滤头过滤，收集2 mL滤液备用。衍生化操作与检测分析：使用的是Waters公司的Accq-Tag试剂盒，详细情况见使用说明书。

2 结果与分析

2.1 标准品试验

精密吸取一定量的混标溶液，按“1.4”的色谱条件进样分析（图1）。出峰顺序分别是GA（没食子酸）、EGC（表没食子儿茶素）、CAF（咖啡碱）、C（儿茶素）、EC（表儿茶素）、EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）、GCG（没食子儿茶素没食子酸酯）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）。从图1可知，各组分的分离度良好。

2.2 酸茶中儿茶素的组成分析

取酸茶茶样，分别进样测试（图2、图3、图4和图5），并依据获得的各目标组分的峰面积值计算各组分在茶样中的含量，得到茶叶中C、EC、EGC、ECG、EGCG、GCG等6种儿茶素以及GA（没食子酸）的含量，结果见表3。由图1、图2、图3和图4可以看出，茶叶中各组分的分离度良好。

从表3可以看出，与对照相比，经过发酵后的酸茶中儿茶素总量增加，无菌发酵和自然发酵得到的酸茶中儿茶素总量较接近，增幅分别为13.80%和13.52%。从各个单体来看，EC（表儿茶素）、EGC（表没食子儿茶素）经过发酵后含量明显增加，EC在无菌发酵和自然发酵样中增幅分别为51.30%和57.52%，EGC在无菌发酵和自然发酵样中增幅分别为64.39%和97.56%。C（儿茶素）在酸茶中的含量与对照相比略有下降。ECG（表儿茶素没食子酸酯）、EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）、GCG（没食子儿茶素没食子酸酯）的含量与对照相比均有所下降，自然发酵的下降幅度大于无菌发酵。总体而言，经过发酵，酯型儿茶素（ECG、EGCG、GCG）含量下降，非酯型儿茶素（EC、EGC）含量上升。GA（没食子酸）经过发酵后含量大幅增加，无菌发酵和自然发酵的酸茶中GA含量分别是對照样的14倍和21倍。

2.3 游离氨基酸的组成分析

试验运用HPLC法对酸茶中游离氨基酸组成进行了测定（图6、图7、图8），一共检测出18种氨基酸，它们的出峰顺序依次为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸（表4）。

从表4可以看出，从总量上来看，与对照相比，发酵后酸茶中游离氨基酸总量略有下降，两种不同处理方式得到的酸茶中氨基酸总量非常接近，自然发酵的游离氨基酸总量（8.751 g/kg）略高于无菌发酵的游离氨基酸总量（8.662 g/kg）。

在检测出来的18种氨基酸中，茶氨酸含量最高，所占比例达到了游离氨基酸总量的50%以上，其次为胱氨酸。在18种氨基酸中，与对照相比，发酵后含量上升的氨基酸有天冬氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。丝氨酸、甘氨酸、组氨酸和茶氨酸经过发酵后含量低于对照样。缬氨酸的含量情况在两种处理方式中不同，无菌发酵的含量高于对照样，自然发酵的含量却低于对照样。

在所检测的18种游离氨基酸中，包含了人体8种必需氨基酸中的7种。经过发酵后，酸茶中7种人体必需氨基酸的含量均上升了，其中赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸增加量较多。两种鲜味氨基酸经过发酵后含量也上升，天冬氨酸的含量在发酵之前为0.004 g/kg，发酵之后两种处理方式均上升到0.015 g/kg；谷氨酸发酵前含量为0.359 g/kg，发酵之后在无菌发酵的酸茶中含量下降为0.306 g/kg，但在自然发酵的酸茶中含量却上升为0.372 g/kg。

3 小结与讨论

3.1 发酵方式对酸茶中儿茶素的影响

儿茶素是茶多酚的重要组成成分，试验得到的酸茶苦味减轻，说明经过发酵茶多酚可能被转化，因为儿茶素类如EGCG、ECG很可能被降解成其他酚类物质[5]。试验中儿茶素的含量变化与绿茶[6]及普洱茶[7]中儿茶素的含量变化有所不同，酸茶儿茶素总量增加，在无菌发酵和自然发酵样中增幅分别为13.80%和13.52%。

从各个单体来看，EC（表儿茶素）、EGC（表没食子儿茶素）经过发酵后含量明显增加，EC在无菌发酵和自然发酵样中增幅分别为51.30%和57.52%，自然发酵样中含量高达24.29 g/kg，远远高于绿茶和普洱茶中EC的含量，EGC在无菌发酵和自然发酵样中增幅分别为64.39%和97.56%，自然发酵样中含量高达72.78 g/kg。C（儿茶素）在无菌发酵后含量高达3.89 g/kg，略低于绿茶4.04 g/kg却远低于普洱茶15.83 g/kg。ECG（表儿茶素没食子酸酯）、EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）、GCG（没食子儿茶素没食子酸酯）无菌发酵后含量分别能够达到15.8、41.04、7.82 g/kg。ECG含量低于绿茶含量，远高于普洱茶含量；EGCG含量远低于绿茶含量，高于普洱茶含量；GCG含量与绿茶中含量差不多，远高于普洱茶中的含量。总体而言，经过发酵，酯型儿茶素（ECG、EGCG、GCG）含量下降，非酯型儿茶素（EC、EGC）含量上升。GA（没食子酸）经过自然发酵后含量达到25.71 g/kg，远高于绿茶中GA含量2.91 g/kg，也高于普洱茶中GA含量10.39 g/kg。

3.2 发酵方式对酸茶中氨基酸的影响

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，是生命个体不可或缺的主要营养成分之一，对促进人体生长发育具有重要意义。茶叶含有的氨基酸种类十分丰富，与茶叶品质显著相关，在茶叶加工中参与茶叶香气的形成，对茶汤的滋味、色泽等有明显影响，其特有成分茶氨酸是重点研究的功能成分之一，有抗疲劳、降血压、增强记忆力等多种功效[8，9]。

从总量上来看，酸茶的氨基酸总量略低于未发酵的对照样，但是两种不同发酵方式得到的酸茶的氨基酸总量基本一致，说明发酵方式对酸茶中的氨基酸总量变化影响不显著。

关于茶氨酸的变化，研究结果表明发酵后茶氨酸占氨基酸总量50%以上，其次在鉴定出来的酸茶的氨基酸组分中含量较高的是胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸。不同于绿茶中的氨基酸组分，速溶绿茶经过检测后含量较高的几种氨基酸有茶氨酸、谷氨酸、天氨酸、丝氨酸等[9]，这种现象可能与两者不同的加工过程有关。经过发酵，酸茶的茶氨酸含量从5.679 g/kg下降到4.522 g/kg左右，比大多数绿茶的茶氨酸含量（3.64～9.98 g/kg）略低[6]，这种差异可能与两者的加工方式有关。检测酸茶发现，其中7种人体必需氨基酸的含量均上升，增幅较大的赖氨酸从0.043 g/kg增加至0.200 g/kg左右、亮氨酸从0.063 g/kg增至0.105 g/kg、苯丙氨酸从0.087 g/kg增至0.144 g/kg左右。两种鲜味氨基酸经过发酵含量也上升，天冬氨酸从0.004 g/kg上升到0.015 g/kg，谷氨酸在自然处理茶样中从0.359 g/kg上升为0.372 g/kg，这两种氨基酸对酸茶的呈味有突出贡献。

试验重点研究了酸茶的儿茶素组分和氨基酸组分的变化，希望能为酸茶的开发提供理论依据。如果能够将茶叶开发成酸茶产品走向餐桌，不仅能够丰富茶产品，而且能提高夏秋茶利用率。与云南少数民族家庭制作的酸茶相比较而言，本研究制得的酸茶产品还有许多方面需要完善，比如提高酸茶的口感、筛选酸茶发酵过程中的微生物菌种等，这些都还需进一步深入研究。

参考文献：

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[6] 高 俊，夏 濤，朱 博，等.HPLC-PDA对茶叶中茶氨酸，儿茶素和生物碱的同时分离检测研究[J].安徽农业大学学报，2008， 35（3）：324-328.

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