谷草青贮用耐低温产乳酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及性质研究

2018-07-18赵蕊蕊郭晓军张舒月朱宝成

中国饲料 2018年12期

赵蕊蕊，郭晓军，张舒月，朱宝成

（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071000）

谷草即收获谷穗后的秸秆，是一种优质的牛马等牲畜的饲料原料。我国谷子栽培面积及产量均居世界第一，谷草年产量约0.028亿t（郭勇庆等，2009）。这些丰富的谷草秸秆不仅没有得到有效的利用，反而被随意弃置或者焚烧，处于一种高污染、高消耗、低产出的状况，资源利用率不足70%（江平，2004）。谷草作为反刍动物利用的一种作物秸秆，由于其低含量的蛋白质、高含量的木质素与硅酸盐和不平衡的矿物质营养，单独饲喂会导致反刍动物采食量和营养物质的消化利用率降低（王旭等，2005）。因此，提高谷草秸秆饲喂的价值对于节约资源、保护环境和促进农牧业可持续发展具有重要的现实意义。

采用青贮技术处理后的谷草相比青贮前适口性更好，且可长期保存，同时寄生虫危害的发生率有所降低。而青贮添加剂在饲料青贮中起着关键的作用。乳酸菌是微生物青贮剂中最早应用的菌种。近年来，国内外对于乳酸菌青贮添加剂做了大量的研究。侯美玲等（2015）研究发现，乳酸菌剂的添加能有效地抑制蛋白质水解酶以及酪酸菌的活性，降低氨态氮／总氮，从而有效保存青贮饲料中的营养价值。杨俊峰等（2011）研究表明，乳酸菌是青贮饲料中的主要菌群，其在饲料的发酵过程中起主要作用。但是乳酸菌是一类不形成芽孢的细菌，因此工业化生产不宜保存和运输（吴逸飞等，2013）。从而导致乳酸菌剂应用于生产的成本提高，造成不必要的损失。而芽孢杆菌具有极强的抗逆性，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等（杨立华等，2010），与乳酸菌相比较生产成本可以有效降低，在保存和运输过程中减少损失。因此在工业生产中可以保证微生物菌剂的活性，提高其产品质量（郭夏丽等，2012）。目前国内对于芽孢杆菌作为青贮添加剂鲜有报道。

影响青贮效果的环境因素有很多，其中温度是重要的影响因素之一。陈明霞等（2016）研究发现，高温条件下（45～55℃）接种商品乳酸菌不能提高青贮饲料的发酵品质，低温条件下（5～15℃）乳酸菌发酵缓慢，需要较长时间抑制青贮有害微生物。青贮一般在秋冬季节进行，尤其谷草种植大多在北方或西部地区，收获时温度相对更低。在低温条件下，微生物的代谢速率变慢，影响青贮饲料的发酵品质。因此筛选耐低温的产乳酸芽孢杆菌已成为新的研究热点（倪永清等，2013）。

本研究拟筛选出耐低温且能产乳酸的芽孢菌株，应用于谷草的青贮，以期提高谷草的青贮发酵品质。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品青贮谷草、全株谷草、串叶松香草等。

1.1.2培养基NA、LA培养基参照程丽娟等的方法配制（程丽娟等，2012），筛选培养基、种子培养基、发酵培养基参照刘敏等（2008）的方法配制。

1.2方法

1.2.1初筛取10.0 g样品置于100 mL无菌水中，于180 r/min、10℃摇床上震荡30 min后进行梯度稀释，取10-4～10-6的稀释溶液各100 μL涂布于溴甲酚紫NA平板上，10℃培养24 h。筛选使溴甲酚紫NA平板变黄的菌株，划线分离，4℃保存。

1.2.2复筛将初筛所得菌株活化后按6.0%的接种量接种于发酵液中，于10℃、180 r/min培养48 h。取发酵液1 mL于离心管中，4℃、5000 r/min离心10 min，用溴甲酚紫平板扩散法复筛，选出产黄圈较快且直径较大的菌株。

1.2.3气相色谱分析将通过复筛的菌株进行气相色谱分析，筛选乳酸产量较高的菌株。气相色谱分析条件：检测器温度270℃，进样器温度270℃，柱温初温60℃，梯度升温到220℃，进样量为 2 μL，分流比 50：1，采样时间 30 min。N2000 色谱工作站，采用保留时间定性，内标法定量。

1.2.4菌株的鉴定参照杨继业（2015）、王伟（2014）等的方法从形态学、16S rDNA序列分析和生理生化试验对目的菌株进行种属鉴定。

1.2.5菌株性质研究

1.2.5.1生长曲线生长曲线的测定参照杨继业等（2015）的方法。

1.2.5.2温度耐受性试验参照张舒月等（2018）的方法制备菌液，测定各组菌液600 nm下的吸光度。

1.2.5.3pH耐受性试验参照张舒月等（2018）的方法制备菌液，测定各组菌液600 nm下的吸光度。

1.2.5.4抑霉菌试验参照杨继业等（2015）的方法。通过平板扩散法检测目的菌株对禾谷镰刀菌的抑菌活性。

1.2.5.5菌株产酸时间将活化的菌株以6.0%的接种量接入发酵培养基中，10℃、180 r/min摇床培养，分别于 6、12、18、24 h取 1.5 mL发酵液于离心管中，4℃、5000 r/min离心10 min取上清液，加到溴甲酚紫NA平板孔中，观察产黄圈情况。

2　结果

2.1初筛结果用溴甲酚紫NA平板初筛产酸的菌株，筛选出能在低温条件下生长并使溴甲酚紫NA平板变黄的菌株共29株。

2.2复筛结果通过溴甲酚紫NA平板扩散法进行复筛，筛选出产圈时间快且直径大的菌株11株。

2.3气相色谱分析对复筛得到的菌株的发酵液进行气象色谱分析。经分析得到一株产乳酸较高的菌株F-1，乳酸含量达到1328.9 mg/L，乙酸含量达到435.1 mg/L。以此菌株作为目的菌株进行鉴定及性质研究。

图1　目的菌株产酸情况

2.4菌株鉴定

2.4.1形态学鉴定菌株F-1为革兰氏阳性菌。菌落形态表面光滑，边缘整齐，乳白色，不透明。菌体呈小杆状，存在运动性，无荚膜，芽孢呈杆状。2.4.2分子生物学鉴定将目的菌株的16S rDNA序列在NCBI网站进行同源性比对分析，并构建系统发育树（图2），菌株F-1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）聚在了一起。

图2　菌株系统发育树

2.4.3生理生化试验结合菌株16S rDNA序列分析结果，参考模式菌株的生理生化试验对菌株F-1进行生理生化鉴定试验，结果见表1。综合形态学、生理生化试验、分子生物学鉴定得出F-1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表1　菌株的生理生化试验

2.5目的菌株的性质研究

2.5.1生长曲线菌株F-1的生长曲线见图3。0～6 h处于延缓期，6～10 h达到对数生长期，10～20 h到稳定期，过了20 h菌株进入衰退期，菌株的生物量开始下降。

图3　菌株生长曲线

2.5.2温度耐受性见图4。菌株F-1在不同温度下均能生长，37℃时生长状态最好，并且10℃的生物量与37℃的生物量没有显著差异，可见该菌株可以在低温的条件下很好的生长。

图4　菌株温度耐受试验

2.5.3pH耐受性见图5。pH耐受试验发现菌株F-1在不同 pH条件下均能生长，在pH为3.0时也有生长，说明F-1具有耐酸能力。

图5　菌株pH值耐受试验

2.5.4霉菌抑菌试验

菌株F-1对禾谷镰刀菌的抑菌试验结果见图6。由图可见，F-1有明显的抑菌圈，说明菌株对禾谷镰刀菌有较强抑制作用。这样就可以减少青贮之后禾谷镰刀菌的生长，从而降低青贮后的霉菌毒素。

2.5.5产酸时间菌株F-1在6 h时产酸很少，而在12 h时产酸量明显增大，并且随着时间的延长产酸量越来越大（如图7）。

图6　菌株的抑菌试验

图7　目的菌株产酸时间试验

3　讨论

谷草质地柔软厚实、适口性好、营养价值高，是一种品质良好的禾本科秸秆。李元迎等（2017）报道采用青贮技术处理谷草后可以更好地利用谷草，青贮后的谷草相比青贮前适口性更好，易于保存且可长期保存，同时可减少寄生虫危害的发生。在整个青贮过程中乳酸是主要的有机酸。谷草中碳水化合物等营养成分含量丰富，在厌氧环境下，微生物能够发酵谷草原料中的糖分，产生足够的乳酸，使环境中的pH值迅速下降，从而达到有效抑制其他微生物的繁殖，保证获得良好的青贮饲料品质的目的。青贮过程中外界环境温度也是影响谷草发酵品质的一个重要因素。一般的菌株的最适生长温度在30～40℃，温度过高或者过低都会影响菌株的生长（陈明霞等，2016）。近年，许多研究者就青贮用耐高温乳酸菌进行了筛选（Chen等，2013；Zhang等，2010；Weinberg等，2001、1998；Tamada等，1999），但对青贮用耐低温乳酸菌的报道较少（秦丽萍等，2014；储徐建等，2014；王翠等，2013；王鹏等，2011）。对能够用于青贮的耐低温产乳酸芽孢杆菌也鲜有报道。

从自然发酵的谷草中分离出29株能够在低温环境下生长的产酸菌，通过复筛得到一株产乳酸量较高的菌株F-1，乳酸含量达到1328.9 mg/L，最适生长温度为10℃。通过形态学观察、16S rDNA序列分析和生理生化试验对目的菌株进行种属鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，属于规定的饲料用安全菌株。该菌株能高产乳酸，应用于谷草的发酵能够有效降低发酵过程中的pH，抑制有害微生物的生长，提高发酵品质。菌株耐酸，在pH值为3.0时也能生长。芽孢菌容易运输和保存，在生产实践中有效降低生产成本。从气相的测定结果可以看出F-1也产丙酸和乙酸，丙酸和乙酸对饲料的发酵品质和有氧稳定性均有影响。所以还可对其产乙酸，丙酸的情况做进一步的研究。目前市场上大部分的乳酸菌剂并没有抑制真菌的功效，本试验表明F-1对霉菌有显著抑制作用，能够有效改善谷草的发酵效果。菌株的产酸时间较快，且能在低温环境下生长，在发酵过程中能够更好更快的降低青贮饲料的pH值，达到理想效果。F-1有抗逆性，在不同环境下均能生长，下一步的工作是对菌株的发酵条件进行优化，进一步研究菌株的应用情况。