食源性腹泻副溶血弧菌分离株调查分析

强鑫华 周丽华 王萍 柳秋霞

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是我国沿海地区食源性暴发疾病中最常见的一种病原菌，近几年随着海鲜类食品在市场的广泛流通，VP所引发的食物中毒的发生率也逐渐增多。从我国食源性疾病监控网络数据显示，由VP引起的食物中毒呈显著上升趋势，成为我国首要食源性致病菌［1-2］。本文对125株VP季节分布及感染患者年龄特征、血清分型、毒力基因进行分析，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2014年1月至2016年12月本院肠道门诊急性腹泻患者粪便分离的VP，共125株。

1.2 菌株分离鉴定 采集腹泻患者新鲜粪便或肛拭子按照浙江省CDC《2015年食源性疾病主动监测工作手册》的要求接种培养，对可疑分离菌株经全自动细菌鉴定仪Vitek-compact2鉴定到种。

1.3 菌株血清分型 使用副溶血性弧菌血清分型试剂盒进行菌体抗原（O）与荚膜抗原（K）凝集试验。K抗原分型：直接取新鲜的 3%NaCl营养琼脂培养物进行玻片凝集。O抗原分群：以0.85%生理盐水悬浮培养物制成约7个麦氏单位的均匀悬液，121℃高压1h后取裂解液进行玻片凝集。所用凝集血清均购自日本生研株式会社Denka Seiken公司，效期内使用。

1.4 毒力基因检测 采用热裂解法提取VP模板DNA，具体操作如下：将分离的副溶血菌株接种至5ml营养肉汤，37℃培养过夜，10000r/min离心5min，弃上清液；加入1ml生理盐水，震荡分散细菌，10000r/min离心5min，弃上清液；向沉淀中加100μl无菌蒸馏水，重新振荡悬浮后置100℃水浴10min；13000r/min离心10min，上清液即为PCR扩增所用的模板DNA，最后应用单重PCR检测trh、tdh两种毒力基因。

1.5 主要仪器 Vitek-compact2鉴定仪，生物梅里埃公司生产；DNA Engine PCR扩增仪，美国Bio-Rad公司生产。

2 结果

2.1 感染季节分布特点 125株VP感染患者的发病呈明显季节分布，每年6～10月份为发病高峰期，冬春季发病较少，检出最高峰在8～9月份。见图1。

图1 125株副溶血弧菌年度季节分布特点

2.2 感染患者年龄分布特点 VP感染的腹泻患者年龄21～30岁占37.6%，31～40岁占24.8%，总体以青壮年为居多，见表1。

2.3 血清学分型 125株VP，共分离出17个血清型，其中部分菌株在所购买的血清试剂盒范围内不凝集，血清可分型菌株占93.6%，其中O3：K6占59.2%，O4：K8占10.4%，其他血清型散在分布。本地区感染的VP以O3：K6、O4：K8为优势血清型。

2.4 毒力基因 125株副溶血弧菌分离株中88.0%携带 tdh+/trh-毒力基因，6.40%携带 tdh-/trh-毒力基因，2株携带tdh+/trh+基因。见表2。

表1 125例腹泻感染患者年龄段分布［n（%）］

表2 125株副溶血弧菌血清型分布及毒力基因携带情况

3 讨论

VP主要分布于沿海、海河交界处及海产品中，然而随着经贸交通迅速发展，海产品在内地城市大量销售，但由于不能保证低温贮运或保管不当，发生由VP引起的食物中毒事件越来越多，有沿海地区逐渐向内地发展趋势［3］。不同地区流行的VP菌株存在较大差异。文献报道，湖州地区虽不是沿海城市，但VP感染患者时有发生，且呈逐年递增的趋势。本资料显示，VP感染在夏季盛行，这与夏季气温高，病原菌繁殖迅速，食品易发生变质。从感染人群分析，21～30岁的人感染率最高，处于这个年龄段的人，大多还处于学生阶段亦或是刚步入社会，食用饭店、食堂、快餐店制作及小贩兜售的食品、各类外卖居多，而这些地方食品制作不卫生的可能性较大，增加食源性病原体污染食品的几率。

目前研究认为约75种VP的血清型与人类腹泻有关［4］。本资料显示，17种血清型中主要流行菌型为O3：K6占59.2%；其次是O4：K8占10.4%，与目前国内外流行的血清型基本一致［5-7］。VP主要的致病因子包括耐热的直接溶血素（TDH）和直接溶血相关毒素（TRH）。TDH不仅具有溶血活性，还具有细胞毒性、心脏毒性和肠毒性，是VP的主要毒力因子，TRH具有溶血作用和肠毒素作用，是VP的另一个重要的毒力因子。本资料用单重PCR扩增检测，引起腹泻的VP 88.0%携带tdh+/trh-，2株携带 tdh+/trh+。本资料显示，8株不携带毒力基因 tdh-/trh-的菌株也具有致病性，推测这与III型分泌系统（T3SS）有关。目前研究表明，副溶血弧菌除TRH和TDH两种毒力基因外，还存在T3SS，更有研究报道T3SS1与细胞毒素有关，T3SS2与肠毒素有关［8］。

随着抗生素的滥用、环境因素及食品加工的不规范，使副溶血弧菌引发的食源性疾病治疗难度有所升高，而副溶血弧菌的感染率还出现逐年递增的趋势。因此，应加强对食源性腹泻的预防和监测。