LC—MS/MS法测定人血浆中多粘菌素E浓度分析方法的建立

张莉婷　周春娣　李建祥

【摘要】目的：建立人血浆中多粘菌素E浓度测定的LC-MS/MS方法，方法：样品处理：蛋白沉淀；采用Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）色谱柱；流动相05%甲酸水溶液（A）-05%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱；流速为065 -24mL/min；内标物：多粘菌素B1；质谱检测，正离子模式。结果：多粘菌素E1的线性范围是200～2000 ng/mL（r2=09984），定量下限为200 ng/mL。批内精密度≤42%，批间精密度≤37%；提取回收率在1003%-1135%之间，总体变异系数（%CV）为62%。本方法定量下限低，血浆前处理方法操作简便，节约成本。结论：建立的方法准确精密、稳定可靠，可用于人血浆中多粘菌素E1浓度的检测。

【关键词】 多粘菌素E；LC-MS/MS；蛋白沉淀

【中图分类号】

R764.04【文献标志码】

B【文章编号】1005-0019（2018）06-220-01

多粘菌素是从多粘杆菌培养液中分离出的一种含多种组分的碱性多肽类抗生素，其结构是由环状多肽和脂肪酸结合而成，可分为多粘菌素A、B、C、D、E、K、M和P共8种。其中多粘菌素E在该类抗生素中毒副作用小，在临床上应用较多[1]。多粘菌素E是一种由至少30种不同的成分组成的复杂混合物[2]，其主要成分是多粘菌素E1（colistin A）和少量多粘菌素E2（colistin B）。多粘菌素E对革兰氏阴性菌引起的感染有较强作用，抗菌谱主要为大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、嗜血杆菌和铜绿假单胞菌等病原菌，并且这些细菌对氨基糖苷类，β内酰胺类和氟喹诺酮类等常用抗菌药物的耐药性相当普遍，许多菌更是多重耐药[3]，但是多粘菌素E不易产生耐药性。上世纪70年代多粘菌素因其肾毒性和神经毒性一度被弃用，然而多重耐药革兰氏阴性菌的出现促使多粘菌素重新成为人们治疗革兰氏阴性菌的重要选择，再度被应用于临床[4]，EVANS等人为：多粘菌素E是治疗多重耐药性革兰氏阴性菌感染重要而又有效的手段[5]。目前对多粘菌素E的分析方法主要有HPLC法，MECC法和LC-MS/MS法，由于多粘菌素E的紫外吸收低，因而应用传统HPLC法（紫外检测器）分析对检测器灵敏度要求较高。LC-MS/MS法广泛应用于多粘菌素E的药代动力学、临床检测等领域，在药动学研究中使用该方法需要选择较好的生物样品前处理方法，本研究采用蛋白沉淀样品的前处理方式，建立了血浆中多粘菌素E的LC-MS/MS检测方法，简化了血浆预处理过程，对色谱条件进行优化，为人血浆样品中多粘菌素E浓度的测定提供了更简便易操作和节约成本的方法。

1仪器与材料

11仪器质谱仪API5000（美国Applied Biosystem公司）；岛津高效液相色谱（DGU-20A5在线真空脱气机；LC-20AD液相泵；SIL-20ACXR自动进样器；CBM-20A控制器构成，日本岛津公司）；微量分析天平（XP6，梅特勒-托利多）；高速台式冷冻离心机（5810R，eppendorf）；涡旋震荡仪（M37610-33CN，Thermo）；超纯水系统（Millipore）

12材料多粘菌素E標准品（批号1304FP0708 ，Sigma）；多粘菌素B1标准品（内标，批号：0248069-6，Cayman）；甲酸（色谱纯，sigma）；乙腈（色谱纯，sigma）；甲醇（色谱纯，sigma）；去离子水（Millipore）

2方法

21色谱条件色谱柱Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）；流动相：流动相A为05%甲酸水溶液，流动相B为05%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱见下表；进样量10μL。

22质谱条件ESI：正离子模式；喷雾电压：2000V；去簇电压：90V；碰撞能量：45V；多粘菌素E1离子对5856→1011；多粘菌素B1离子对6025→2413

23血浆样品处理移取100 μL 血浆样品于96深孔板中，加入100 μL稀释液至样品中，加入50 μL 浓度为3000ng/mL 的内标工作液，加入400μL纯水，涡旋使之混匀，加入400μL甲醇，800转涡旋约1分钟，于每分钟3500转，室温下离心10分钟，移取400μL纯水于新的96孔板中，转移200μL上清液至该96孔板中，封板后1000转涡旋约1分钟，于每分钟3500转，室温下离心5分钟，取上清液100μL进样分析。

24线性范围使用不同浓度的标准曲线工作溶液与空白血浆配制出浓度分别为200、400、100、200、400、800、1600和2000 ng/mL的多粘菌素E1血浆样品，按照23项下处理，进样分析，以多粘菌素E1在血浆中的浓度为横坐标（X），以测得到的多粘菌素E1与内标的面积比为纵坐标（y），使用线性最小二乘法回归计算（权重为1/x2），得到定量的线性范围。

25定量下限使用最低浓度的标准曲线工作溶液与空白血浆配制成浓度为200ng/mL的定量下限样品，平行配制6份，按照23项下处理，进样分析，得到最低定量值。

26选择性取6个不同批次未混合的空白人血浆， 除不加内标外，其余按“23”项下处理，进样分析，得到空白血浆样品色谱图与定量下限色谱图对比以考察选择性。

27准确度和精密度使用不同浓度的质控工作溶液与空白血浆配制成定量下限、低、中、高4个QC浓度（200、600、300和1500ng/mL）的质控样品，每个浓度有6个重复的样品，按照23项下处理，测定3个独立分析批（与标准曲线同时进行），得到批内和批间准确度和精密度。

28基质效应分别取6个不同批次的空白人血浆，每个批次配制一份，除不加内标外，按照23项下处理，最终分别加入与处理后的低浓度（600 ng/mL）、中浓度（300 ng/mL）和高浓度（1500 ng/mL）质控样品浓度相当的标准品以及内标溶液进行分析。同时配制无基质存在的与低、中、高浓度质控样品浓度相当的纯溶液，平行三份，进样分析。用有基质存在的样品中分析物与内标物峰面积比值与纯溶液中分析物与内标的平均峰面积比值相除来计算内标归一化的基质效应因子。

29提取回收率3个浓度水平（600、300和1500 ng/mL）的基质样品分别平行配制六份，除不加入内标溶液外，按照23项下处理，最终稀释前，加入合适的内标溶液，确保其浓度与低浓度，中浓度和高浓度质控样品提取后浓度相同。同时配制回收率参比样品，提取过程与上述相同，但是分析物和内标溶液均在提取后，最终稀释前加入。用常规提取样品中分析物与内标的峰面积比值与回收率参比样品中分析物与内标峰面积比值相除来计算多粘菌素E1在不同浓度水平的回收率。

210残留评价在标准曲线定量上限样品进样后进一针空白基质样品，通过比较空白基质样品中分析物和内标物峰面积与定量下限样品平均峰面积来评价本方法的残留。

211人血浆短期稳定性分别将低（600 ng/mL）、高（1500 ng/mL）两个浓度的人血浆质控样品放置湿冰条件下（4h至24h），随新鲜配制的标准曲线样品一同测定，每个浓度水平平行测定6份。

212人血浆冻融稳定性分别将低（600 ng/mL）、高（1500 ng/mL）两个浓度的人血浆质控样品经过4次冻融循环（-70℃，湿冰上融化）后随新鲜配制的标准曲线样品一同测定，每个浓度水平平行测定6份。

3结果

31线性范围与定量下限多粘菌素E1在人血浆中线性范围为200～2000 ng/mL。直线回归方程为y=0002931x-0004906， 加权因子为（1/x2），r2为09984，最低定量下限为200 ng/mL。

32选择性在6个不同批次的空白人血浆样品，与定量下限样品（如图1所示）对比，在多粘菌素E1和内标物保留时间处都没有观察到色谱峰信号（如图2所示）表明本方法测定人血浆中多黏菌素E1的选择性良好，血浆基质对测定无干扰。

33准确度和精密度多粘菌素E1在人血浆中每一浓度水平多黏菌素E1质控样品的批内准确度在±81%以内，批内精密度≤42%，所有浓度水平的批间准确度在±65%以内，批间精密度≤37%。均符合接受标准。

34基质效应结果如表1-1所示，多粘菌素E1在人血浆中，在所有浓度水平内标归一化的基质效应因子为098～102，精密度≤39%，符合基质效应的考察标准。

35提取回收率在所有浓度水平使用本提取方法，结果如表1-2所示，多粘菌素E1在人血浆中的平均回收率在1003%-1135%之间，总体回收率为1062%

36残留评价分析物的进样残留峰面积在定量下限样品峰面积的03%以内，且内标的进样残留峰面积在可接受分析批标曲样品和质控样品平均内标峰面积的00%以内，表明以本方法测定人血浆中多黏菌素E1高浓度样品进样后在系统中无明显残留，对于后续低浓度样品的测定无影响，样品分析时对样品排放顺序没有要求。

37人血浆短期稳定性将样品放置在湿冰条件下18小时后进样分析，结果如表1-3所示，表明多粘菌素E1在该基质中湿冰上放置18小时稳定。

38人血浆冻融稳定性样品经过4次冻融（-70℃，湿冰上融化）循环后，以新鲜制备的标准曲线测定，結果如表1-3所示，表明多黏菌素E1血浆样品可稳定至少4次冻融循环。

4讨论

在高效液相色谱法中，由于缺乏有效的发色团，多粘菌素E的紫外吸收非常弱又没有荧光，在样品分析时直接采用传统技术（紫外检测器）是不能得到一个高灵敏度的定量结果的[6]，因此如果使用HPLC对多粘菌素进行分析，就需要其他检测器如蒸发光散射检测器及荧光检测器，或是对样品进行柱前衍生化处理，来得到一个较好的响应值。Jian Lia[7]等采用氯甲酸（9-芴甲基）酯进行柱前衍生化，用荧光检测器-高效液相色谱法测定人血浆中多粘菌素E的含量，可得到稳定的衍生物，结果选择性好，灵敏度高，但是却有柱前衍生化耗时且保留时间太长的缺点。近年来，高效液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高，可获得较低的定量限，线性范围较宽而被广泛应用于生物制品中多粘菌素E的分析，但需要有较好的前处理技术（尤其生物制品）、干净的流动相系统，良好的操作技术要求，用以保护质谱，延长使用寿命[6]，Zheng Ma[8]等采用固相萃取技术对生物样品进行预处理，使用LC/MS-MS法检测人血浆，尿液和其他生物制品中多粘菌素E1的含量，固相萃取技术可除去生物样品中的内源性杂质，得到较干净的样品用于分析，但是固相萃取板价格昂贵，使得实验成本大大提高。超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC/MS-MS）由于其分析时间短，灵敏度高，近年来也被常用于多粘菌素E药动学研究，Miao Zhao[9]等采用弱离子交换固相萃取板对样品进行前处理，开发并验证了UPLC/MS-MS法检测人血浆和尿液中多粘菌素的含量的方法。Giuliana Cangemi[10]等采用蛋白沉淀的前处理方式开发了UPLC/MS-MS法检测人血浆中多粘菌素E含量的方法。

本文建立了高效液相色谱-串联质谱法检测人血浆中多粘菌素E1的生物分析方法。样品经甲醇沉淀蛋白，取上清液分析，结果表明，多粘菌素E1的线性范围是200～2000 ng/mL，定量下限为200 ng/mL，而有文献报道为28 ng/mL甚至更高[8]，因此本方法定量下限更低；在人血浆中多粘菌素E1的提取回收率在1003%～1135%之间，批内批间精密度均不大于42%；多粘菌素E1血浆样品可在湿冰中稳定至少18小时，可稳定至少4次冻融循环。本研究优化了高效液相色谱、质谱条件，同时采用了最为优化的蛋白沉淀提取方式，与固相萃取等前处理方法相比，操作简便易行，技术难度低，准确度高，稳定性良好，同时又节约成本，经方法学验证，本研究所建立的LC-MS/MS方法具有选择性，准确性，精密性，且稳定可靠，符合相关规定，可用于大量人血浆样品中多粘菌素E1的分析。

参考文献

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