甲基莲心碱减轻D-半乳糖胺/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤作用研究

王念,魏纯玲，蒋世双，陶武，唐泽

急性肝损伤是指在较短时间内迅速发生的肝细胞损伤[1]。目前，我国急性肝损伤患者主要以药物性肝损伤为主，且发病率逐年增加[2]。研究表明[3]，莲心碱对肝脏有保护作用，可清除氧自由基、减轻脂质过氧化损伤。甲基莲心碱属于莲心碱的一种，其可以有效清除氧自由基[4]。目前，国内少有关于应用甲基莲心碱治疗急性肝损伤的研究。本研究采用D-半乳糖胺/脂多糖诱导昆明种小鼠急性肝损伤，通过测定小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、谷胱氨肽（GSH）、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α)、白细胞介素-6（IL-6)和白细胞介素-10（IL-10)水平，观察了甲基莲心碱对急性肝损伤的保护作用，并对其机制进行了初探，以期为急性肝损伤的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、药品与试剂 80只昆明种雄性小鼠购于重庆市实验动物中心【动物许可证号：SCXK（渝）2016-0001]，SPF级，8周龄，体质量 15～25 g,实验前适应性饲养1 w。Allegra25R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司），7600全自动生化分析仪（日本日立公司）、UV1800紫外分光光度计（日本岛津公司），ELx800酶标仪（美国BioTek公司）。甲基莲心碱（HPLC≥98%）、脂多糖、D-半乳糖胺（大连美仑美生物技术有限公司），检测ALT、AST、SOD、MDA、GSH、TNF-α、IL-6和IL-10试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 急性肝损伤小鼠模型构建[5]将80只小鼠随机分为正常组、模型组、小剂量甲基莲心碱组和大剂量甲基莲心碱组，每组20只。给予正常组和模型组小鼠生理盐水灌胃，在小剂量甲基莲心碱组和大剂量甲基莲心碱组小鼠，分别给予100 mg.kg-1和300 mg.kg-1甲基莲心碱溶液灌胃。在模型组、小剂量和大剂量甲基莲心碱组小鼠，在末次给药后1 h，按0.2 mL/10 g体积给予脂多糖（40 μg.kg-1）和 D- 半乳糖胺（600 mg.kg-1）腹腔注射，构建急性肝损伤小鼠模型。观察小鼠造模后表现，并给予少量水和饲料，12 h后进行实验取材。

1.3 观察与检测和检查 造模12 h后，每组取10只小鼠，摘眼球取血。离心后取血清，行有关检测。取血后，处死小鼠，解剖并取肝脏，制备切片，观察其病理学变化。在每组剩余10只小鼠，观察存活时间。

1.4 统计学处理 应用SPSS 23.0软件对数据进行处理。对服从正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Newman-Keuls检验。采用Kaplan-Meier法分析各组小鼠存活率的差异。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠血清ALT和AST水平比较 与正常组比，模型组、小剂量甲基莲心碱组和大剂量甲基莲心碱组小鼠血清ALT和AST水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；甲基莲心碱处理组动物血清ALT和AST水平显著低于模型组（P＜0.01）；大剂量甲基莲心碱组小鼠血清ALT和AST水平均显著低于小剂量甲基莲心碱组（P＜0.01，表1）。

表1 四组小鼠血清ALT和AST水平（±s）比较

表1 四组小鼠血清ALT和AST水平（±s）比较

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05；与小剂量甲基莲心碱组比，③P＜0.05

只 ALT（U/L） AST（U/L）正常组 10 65.3±16.5 127.1±25.3模型组 10 272.4±42.8① 497.2±62.1①小剂量甲基莲心碱 10 198.6±39.2①② 327.9±60.6①②大剂量甲基莲心碱 10 138.8±28.9①②③ 223.0±45.5①②③

2.2 各组小鼠血清SOD、MDA和GSH水平比较 与正常组比，模型组、小剂量甲基莲心碱组和大剂量甲基莲心碱组小鼠血清SOD和GSH水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01)，而血清MDA水平显著升高（P＜0.01）；甲基莲心碱处理组小鼠血清SOD和GSH水平显著高于（P＜0.01），而血清MDA水平显著低于模型组（P＜0.01）；大剂量甲基莲心碱组小鼠血清SOD和GSH水平显著高于小剂量甲基莲心碱组（P＜0.01），而血清MDA水平显著低于小剂量甲基莲心碱处理组（P＜0.01，表2）。

2.3 各组小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平比较 与正常组比较，模型组、小剂量甲基莲心碱组和大剂量甲基莲心碱组小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平均显著升高（P＜0.05)；甲基莲心碱处理组小鼠血清TNF-α水平显著低于模型组（P＜0.05），大剂量甲基莲心碱处理组小鼠血清IL-6和IL-10水平与模型组比较，差异显著（P＜0.05）；大剂量甲基莲心碱处理组小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平与小剂量甲基莲心碱处理组比，差异无统计学意义（P＞0.05，表 3）。

表2 四组小鼠血清SOD、MDA和GSH水平（±s）比较

表2 四组小鼠血清SOD、MDA和GSH水平（±s）比较

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05；与小剂量甲基莲心碱组比，③P＜0.05

只 SOD（U/mL） MDA(mol/L)GSH(μmol/L)正常组 10 92.4±7.4 4.0±0.8 33.0±2.9模型组 10 37.5±6.2① 9.2±1.4① 11.8±2.7①小剂量甲基莲心碱 10 61.8±5.5①② 7.6±1.2①② 20.4±2.2①②大剂量甲基莲心碱 10 82.5±7.3①②③ 6.1±0.9①②③ 26.6±2.8①②③

表3 四组小鼠血清细胞因子水平（pg/ml,±s）比较

表3 四组小鼠血清细胞因子水平（pg/ml,±s）比较

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

只 TNF-α IL-6 IL-10正常组 10 440.2±52.5 100.6±19.8 81.0±8.4模型组 10 587.6±48.9① 153.4±18.0① 96.4±9.7①小剂量甲基莲心碱 10 511.2±50.4①②136.6±18.4① 104.3±9.8①大剂量甲基莲心碱 10 489.0±46.3①② 122.1±18.8①② 110.5±10.1①②

2.4 各组小鼠肝组织病理学表现的变化 正常组小鼠肝组织细胞排列规则，无炎性细胞浸润或细胞坏死；模型组小鼠肝组织炎性细胞浸润明显，肝细胞呈灶性坏死；小剂量甲基莲心碱处理组小鼠肝组织有少量炎性细胞浸润，细胞排列较混乱；大剂量甲基莲心碱处理组小鼠肝组织病变减轻，仅有小部分炎性细胞浸润（图1）。

图1 各组小鼠肝组织病理学表现（HE，400×）

2.5 实验组动物存活率比较 模型组小鼠12 h存活率为60.0%，24 h存活率为10.0%；小剂量甲基连心碱处理组小鼠12 h存活率为80.0%，24 h存活率为50.0%，而大剂量甲基莲心碱处理组小鼠12 h存活率为90.0%，24 h存活率为70.0%（图2），组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 三组小鼠存活率比较

3 讨论

磷酸尿苷对维持肝细胞结构和功能有着重要的作用[6]，D-半乳糖胺能够降低肝细胞内磷酸尿苷含量[7]。脂多糖可激发机体免疫系统，进而释放大量的炎性细胞因子，阻碍肝脏微循环，引发肝脏缺血、缺氧和氧化应激反应等，引起肝损伤[8-9]。本研究通过观察模型组小鼠存活情况，得知24 h内死亡10只，存活率仅为10.0%。同时，血清ALT和AST水平急剧升高。进一步观察肝组织病理学表现发现，肝组织细胞排列混乱，大量炎性细胞浸润，肝细胞呈现灶性坏死。以上结果表明，本次通过D-半乳糖胺和脂多糖诱导的急性肝损伤小鼠模型制备成功。

给予小鼠甲基莲心碱预处理后，其血清ALT和AST水平降低，肝组织病理学切片观察显示肝损伤情况得到一定程度的缓解，而小鼠存活率也得到明显提升，提示应用甲基莲心碱对于D-半乳糖胺和脂多糖诱导的急性肝损伤具有保护作用。当机体处于氧化应激状态时，会发生脂质过氧化，血清MDA水平升高[10]。本研究模型组小鼠血清MDA水平急剧升高，表明其氧化应激程度较高。SOD可催化超氧阴离子分解，产生氧气和过氧化氢[11]。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶的底物，能反映机体抗氧化和清除氧自由基的能力，其与抗氧化酶共同作用，减弱氧化应激损伤[12，13]。本研究结果显示，模型组小鼠血清SOD和GSH水平降低，表明其肝脏内发生了剧烈的氧化应激反应，与以往研究结果一致[14-16]。给予甲基莲心碱灌胃处理的小鼠，其血清MDA水平显著降低，而血清SOD和GSH水平显著升高，表明甲基莲心碱可有效抑制肝脏内氧化应激反应，有效保护肝脏损伤。有研究[17，18]显示，在肝脏发生急性损伤时，机体释放大量的TNF-α和IL-6等炎性细胞因子，促进炎性细胞浸润，导致炎性反应更趋严重。IL-10具有抗炎作用，能够直接抑制TNF-α生成，间接抑制IL-6生成[19，20]。本研究发现，甲基莲心碱能够降低急性肝损伤小鼠血清TNF-α和IL-6水平，升高IL-10水平，其结果说明甲基莲心碱还可以调节炎性因子的释放，进而发挥保护肝脏作用。

综上所述，甲基莲心碱可抑制氧化应激反应，有效保护肝脏损伤，其机制可能与降低血清MDA、TNF-α和IL-6水平，升高SOD、GSH和IL-10水平有关。下一步我们将检测小鼠肝组织SOD、GSH、MDA、TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA水平，进一步从基因水平研究甲基莲心碱保护肝脏的分子机制。