ON123300对ER阳性人乳腺癌MCF-7细胞的影响及机制研究

林荣杰 尹 航 周云峰

乳腺癌的发病率已经位居我国城乡女性恶性肿瘤的首位，是危及女性生命健康最主要的恶性肿瘤之一，并呈现明显的上升趋势[1]。约75%的乳腺癌患者为激素受体阳性(HR+)的乳腺癌，内分泌治疗为此类患者提供了重要帮助，然而内分泌药物耐药是HR+乳腺癌治疗面临的最大挑战[2-3]。虽然CDK4/6抑制剂Palbociclib能够有效克服内分泌耐药，但仍然存在原发耐药和继发耐药问题(耐药率分别约16%和约50%)[4]。其机制可能与其脱靶有关，脱靶问题也成为目前制约激酶抑制剂应用的最主要原因之一[5]。因此，设计更高效的针对CDK4的抑制剂从而避免其脱靶现象是亟待解决的问题。

ON123300是一种新型的以CDK4/6为主要靶点的多靶点激酶抑制剂，有研究报道其在多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤及脑部肿瘤都呈现很好的疗效，相比于一代Palbocilib效果优势明显[6-8]。但ON123300在乳腺癌中的作用效果尚无报道。本研究旨在探讨其对ER+，HER2-的乳腺癌细胞MCF-7增殖、周期、凋亡等影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物与试剂

MCF-7细胞购于中科院上海生物细胞所；ON123300(S8161)购于上海蓝木化工有限公司；Palbocilib(PD0332991)购于Med Chem Express(MCE)公司；CCK-8试剂盒(c 6005)购于苏州宇恒生物科技有限公司；Propidium iodide(PI)(P4170)购于Sigma公司；核糖核酸酶A(RNase A)(R4875)购于Sigma公司；细胞凋亡试剂盒(F6012)购于苏州宇恒生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MCF-7细胞培养于含10%的小牛血清及100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的MCF-7细胞，接种于96孔培养板，每孔约5×103个细胞于100 μL培养基中孵育过夜后加药，DMSO对照组分别给予0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM、10 μM的ON123300或Palbocilib处理，每个浓度设置6个复孔；于培养箱中孵育48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养4 h后在酶联免疫检测仪450 nm波长测量各孔吸光度(OD)值并计算不同浓度药物对细胞的抑制率。计算公式：细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡 收集加药后培养48 h的细胞，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，PBS重悬润洗2次；离心去上清，100 μL PBS重悬细胞，缓慢加入700 μL预冷的80%乙醇，使乙醇终浓度为70%；4℃固定4 h以上；1 000 rpm，5 min，预冷PBS润洗2次；加入100 μL RNase A(50 μg/mL)，37℃孵育30 min；加400 μL PI(50 μg/mL)，4℃避光染色30 min；流式细胞仪检测细胞周期。按细胞凋亡试剂盒实验步骤操作后于FCM检测细胞凋亡。CytExpert软件分析细胞周期及凋亡情况。

1.2.4 Western blot 收集DMSO对照组、ON123300低浓度处理组(0.5 μM)和ON123300高浓度处理组(5.0 μM)细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加热变性后上样，经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，4℃一抗孵育过夜，二抗室温孵育一小时后ECL显影。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验，计数资料使用卡方检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ON123300及Palbocilib对MCF-7细胞生长状态的影响

光学显微镜下可见，DMSO对照组细胞贴壁生长、增殖迅速，细胞生长状态良好；ON123300加药组较对照组及同浓度Palbocilib加药组出现明显的细胞增殖抑制，细胞明显回缩脱落，细胞生长状态差，并且呈现剂量依赖现象，ON123300剂量越高，MCF-7细胞生长状态越差(图1)。

2.2 ON123300及Palbocilib对MCF-7细胞增殖抑制的影响

与DMSO对照组相比，ON123300及Palbocilib对MCF-7的增殖抑制率随浓度增高而增大(P<0.05)，同浓度的ON123300较Palbocilib对MCF-7的增殖抑制作用更强(P<0.05)。ON123300作用于MCF-7细胞的IC50为3.51 μM，而Palbocilib作用于MCF-7细胞的IC50为7.96 μM(图2)。

ON123300会引起MCF-7细胞周期阻滞，与DMSO对照组相比，ON1233300处理组的MCF-7细胞出现明显的G1/S期阻滞，G1期明显延长，S期明显缩短，对比组之间差异具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图1 各组MCF-7细胞形态学改变情况Figure 1 The morphological changes of MCF-7 cells in each groupNote：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM Palbocilib for 48 h；C.The cells were treated with 5.0 μM Palbocilib for 48 h；D.The cells were treated with 0.5 μM ON123300 for 48 h；and E.The cells were treated with 5.0 μM ON123300 for 48 h.

图2 Palbocilib和ON123300对细胞增殖率的影响Figure 2 The proliferating rates of MCF-7 cells treated with palbocilib or ON123300

图5 ON123300对survivin/cyclinD1/CDK4/Rb和PI3K的蛋白表达的影响Figure 5 The expression of survivin/cyclinD1/CDK4/Rb and PI3K protein in MCF-7 cells treated with different concentrations of ON123300

图3 ON123300对MCF-7细胞周期的影响Figure 3 The distribution of cell cycle in MCF-7 cells treated with ON123300Note：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM of ON123300 for 48 h；and C.The cells were treated with 5.0 μM of ON123300 for 48 h.

2.3 ON123300促进MCF-7细胞凋亡

与DMSO对照组相比，ON123300低浓度组(0.5 μM)和高浓度组(5.0 μM)均出现明显凋亡，且以高剂量组更显著，对比组之间差异具有统计学意义，(P<0.05)(图4)。

2.4 ON123300对MCF-7细胞的影响机制

与DMSO对照组相比，ON123300处理组的survivin、cyclinD1、CDK4、pRbs807/811及PI3K的蛋白表达量均明显降低，对比组之间差异具有统计学意义(P<0.05)(图5)。

图4 流式细胞术检测细胞凋亡情况Figure 4 The apoptosis of MCF-7 cells treated with ON123300 by flow cytometryNote：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM of ON123300 for 48 h；C.The cells were treated with 5.0 μM of ON123300 for 48 h；and D.The apoptosis of MCF-7 cells treated with ON123300.

3 讨论

乳腺癌已成为我国女性第一大高发恶性肿瘤，严重危害女性的生命健康[9-10]。其中ER+、HER2-的乳腺癌患者约占3/4，内分泌治疗耐药成为影响此类患者生存获益的主要瓶颈之一。目前，以Palbocilib为代表的细胞周期依赖性激酶CDK4/6抑制剂已被FDA批准联合内分泌治疗用于ER+、HER2-的乳腺癌患者治疗[11]，但是CDK4/6抑制剂在临床应用中存在脱靶及耐药问题限制其应用[4]。分析主要原因可能为目前使用的CDK4/6抑制剂的效价并不高，另外在乳腺癌中存在其他参与细胞周期信号通路的持续激活如PI3K信号通路，细胞周期抑制剂P21和P27同时受其调控，从而参与调控细胞周期[4]。因此，与CDK4/6单靶点抑制剂相比，高效抑制CDK4/6且同时抑制PI3K激酶的药物可能具有较好的疗效。

ON123300是一种高效的基于CDK4/6的多靶点激酶抑制剂，体外Kinase assay实验显示其抑制CDK4/cyclinD1的IC50为3.87 nM[12]。在套细胞淋巴瘤中，ON123300通过双重抑制CDK4/Rb和PI3K/Akt/mTOR信号通路不仅引起细胞周期阻滞，高浓度明显促进细胞凋亡，而一代的CDK4/6抑制剂Palbocilib并不能促进细胞凋亡[7]。

本研究发现，与Palbocilib相比，ON123300对乳腺癌细胞MCF-7具有更强的增殖抑制作用，细胞出现明显的脱落。ON123300引起MCF-7细胞明显的G1/S期阻滞，并伴有严重凋亡。有研究表明，survivin与CDK4结合形成survivin/CDK4复合物，竞争性地使P16与CDK4分离，将CDK4运送至细胞核后被cyclinD1/CDK4复合物取代，引起Rb磷酸化进而使细胞从G1期进入S期[13-15]。本研究Western blot结果显示ON123300不仅明显抑制MCF-7细胞中对细胞周期起重要调控作用的survivin/cyclinD1/CDK4/Rb信号通路，同时抑制了乳腺癌中调控细胞周期的PI3K信号通路，因此较Palbocilib这类特异性的CDK4/6抑制剂，ON123300不仅对CDK4/cyclinD1靶点有更强的抑制作用，而且可以有效抑制PI3K激酶，从而阻滞双重周期相关通路。因此ON123300既避免了Palbocilib等一代CDK4/6抑制剂因效价不高而出现的脱靶现象，又避免了单靶点抑制剂对细胞周期通路抑制的不充分性。

综上所述，ON123300通过双重高效抑制CDK4和PI3K激酶靶点，继而抑制survivin/cyclinD1/CDK4/Rb和PI3K信号通路，对ER+、HER2-的乳腺癌细胞具有明显增殖抑制，促进G1/S期细胞阻滞和细胞凋亡的作用。与一代Palbocilib相比，具有明显的杀伤优势。ON123300有望成为治疗ER+、HER2-乳腺癌患者的有效药物，其临床应用效果和价值需要进一步研究验证。