活菌制剂和复合酶制剂对青贮玉米秸秆化学组成及纤维微观结构的影响

2018-07-16毛建红王玉荣许贵善刁其玉

动物营养学报 2018年7期

毛建红　陶　莲　刘　融　王玉荣　许贵善　刁其玉*

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 100081；2.塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300)

我国是农业大国，农作物秸秆资源丰富，特别是玉米秸秆，是反刍动物重要的粗饲料来源之一。秸秆细胞壁由纤维素、半纤维素、木质素、部分果胶等其他化学成分组成，其中纤维素占据整个细胞壁的30%～50%，是反刍动物可以直接利用的碳源[1]。但是秸秆细胞壁中，木质素作为一种芳香族高分子化合物，与半纤维素形成稳定的木质素-碳水化合物复合体，将纤维素和半纤维素包裹其中，使瘤胃微生物与纤维素降解酶不能直接接触纤维素，如能有效破解秸秆细胞壁复合体结构，则可以提高生物制剂的作用效果，从而提高秸秆的利用率[2-3]。因此，对秸秆进行破壁处理，是提高秸秆饲料化利用率的关键步骤，其主要目的是破解或去除秸秆中的抗营养结构，增加微生物与酶的可及性，提高纤维素的降解速率和转化率[4]。纤维素具有特定的一级、二级、三级、四级结构，分别用聚合度、氢键作用力、结晶度和比表面积进行表征，而表征指标的变化则可以代表纤维微观结构的变化，进而代表秸秆被降解的程度[5]。目前，大部分学者主要是以改善秸秆营养品质、提高秸秆饲料利用率为研究重点，但是在秸秆生物处理过程中，秸秆细胞壁纤维结构的破解程度与秸秆主要纤维成分，如中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、纤维素、半纤维素的相关却鲜有报道。观察并分析秸秆细胞壁的纤维形态和微观结构，可以从分子水平揭示秸秆饲料化的作用机制，对评价秸秆饲料的营养价值具有很大的作用。因此，本研究以玉米秸秆为试验材料，研究生物发酵前后秸秆的营养成分、发酵品质和纤维微观结构变化，旨在为秸秆饲料化利用的技术提供支撑。

1　材料与方法

1.1　试验材料

玉米秸秆取自河北省保定市，品种为金玉99，于2016年9月收获籽实后收割。采集的玉米秸秆经65 ℃烘干48 h后，混合均匀，粉碎至40目用于营养成分和微观结构测定。

酶制剂：纤维素复合酶[纤维素酶(cellulase，≥10 000 U/g)+木聚糖酶(xylanase，≥120 000 U/g)+β-葡聚糖酶(β-glucanase，≥40 000 U/g)]、果胶酶(pectinase，≥10 000 U/g)、漆酶(laccase，10 000 U/g)，试验所用复合酶制剂及酶制剂均购自夏盛实业集团有限公司，粉末状，常温贮存。

活菌制剂：植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum，≥2×106CFU/g)、布什乳酸杆菌(Lactobacillusbuchneri，≥2×106CFU/g)，菌种保藏于中国农业科学院饲料研究所，活菌制剂冻干粉，置于4 ℃冰箱保存。

1.2　试验设计

本试验共设计5个组，分别为：秸秆原料组(CS组)、青贮对照组(CK组)、复合酶制剂组(CPL组)、复合酶-单活菌组(CPLP组)、复合酶-双活菌组(CPLB组)。

处理方法如下：玉米秸秆刈割后，用青贮切碎揉搓机切短至1～2 cm，按表1的分组及添加剂量溶于蒸馏水，搅拌，将生物制剂均匀喷洒在粉碎的玉米秸秆上，水分调节至65%～70%。样品均装入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)，每袋1 kg，用真空包装机(DZ-280/2SD)抽真空并封口，室温(25～37 ℃)贮藏45 d后开封取样。CK组直接添加蒸馏水，不添加任何生物制剂。另取玉米秸秆原料样品置于冰盒中，迅速带回实验室，-20 ℃贮藏，待检。每个组4个重复，3个用于样品测定，1个为备用。

表1　试验设计

1.3　测定项目和方法

1.3.1发酵品质及营养成分测定

取玉米秸秆青贮20 g，加入180 mL蒸馏水，匀浆1 min，用4层纱布过滤，用pH测定仪(Testo 205，德国)测定青贮浸出液的pH[6]。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮(NH3-N)含量[5]。使用GC128型气相色谱仪分析乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)的含量，分析条件为：火焰离子化检测器(FID)，柱2 m×4 mm，固定相Pora-pak Q(80目)，柱温120 ℃，检测器和进样器温度230 ℃，氮气(N2)流速65 mL/min，空气流速300 mL/min，氢气(H2)流速30 mL/min，灵敏度16×103，纸速5 mm/min。化学分析法测定玉米秸秆生物发酵前后的营养成分含量，包括干物质(dry matter，DM)、粗蛋白质(crude protein，CP)、NDF、ADF、木质素(lignin，L)[7]。

纤维素(cellulose，C)=ADF-
酸性洗涤木质素(ADL)；
半纤维素(hemicellulose，HC)=NDF-ADF；
总氮(total nitrogen，TN)含量=CP/6.25。

1.3.2玉米秸秆微观结构的测定

1.3.2.1一级结构——聚合度

玉米秸秆样品粉粹过40目，采用苯酚-硫酸法测定玉米秸秆样品中的总糖含量，4，4′二羧酸-2，2′-喹啉(BCA)法测定玉米秸秆样品中还原糖含量，总糖与还原糖的比值，即为玉米秸秆纤维素的聚合度[8]。

1.3.2.2二级结构——傅里叶转换红外光谱(FTIR)图谱

使用VERTEX 70V FTIR仪(Bruker 公司，德国)对不同组的玉米秸秆样品进行扫描电镜观察，得出FTIR图谱[5]。试验处理：玉米秸秆样品粉碎2 min，过40目；65 ℃干燥12 h后，称取1 mg样品与50 mg溴化钾(KBr)研磨均匀，使用FW-5压片机，压强1 Mpa，30～60 s，压成直径约13 mm的薄片。试验条件：扫描范围在1 000～4 000 cm-1区间，光谱分辨率2 cm-1。

1.3.2.3三级结构——X射线衍射(XRD)图谱

使用D8-Advance型XRD仪(Bruker公司，德国)对不同组的玉米秸秆饲料进行XRD扫描，得出XRD图谱[5]。试验处理：各组样品均粉碎2 min，过40目。试验条件：Cu-Ka，40 kV×40 mA，扫描速度1 ℃/min，步长0.04°，2θ扫描范围3°～40°。观察不同处理后的样品结晶度变化，并根据Meyer等[9]提出的公式计算结晶度：

CrI(%)=[(I002-Iam)/I002]×100。

式中：CrI表示结晶度；I002表示纤维素Ⅰ在2θ为22°～23°时结晶强度的最大值(对于纤维素Ⅱ，2θ为18°～22°)；Iam表示纤维素Ⅰ在2θ为18°～19°时结晶强度的最小值(对于纤维素Ⅱ，2θ为13°～15°)。

1.3.2.4四级结构——比表面积

采用伊红美兰法测定样品的比表面积[10-11]。玉米秸秆样品粉碎过40目，取0.2 g悬浮于25 mL美兰溶液中，恒温25 ℃，转速120 r/min，10 000 r/min离心15 min，取得上清液，在660 nm的波长下进行比色，测得溶液中美兰的含量，单位质量玉米秸秆样品吸附剂吸附美兰的量可引据下列公式计算出：

q=[(C0-Ct)×V]/m。

式中：q表示单位质量玉米秸秆样品吸附美兰的量(mg/g)；C0表示美兰的初始浓度(mg/L)；Ct表示t时刻美兰的浓度(mg/L)；V表示美兰溶液的体积(L)；m表示玉米秸秆样品的质量(g)。

S=q×a。

式中：S表示比表面积(m2/g)；q表示单位质量玉米秸秆样品吸附美兰的量(mg/g)；a为1 mg美兰覆盖固体的面积，对秸秆物质为2.45 m2。

1.4　数据统计分析

试验数据经过Excel 2007初步整理后，采用SPSS 21.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVE)检验程序进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著。

2　结果与分析

2.1　青贮玉米秸秆的营养成分

由表2可以看出，与CS组相比，玉米秸秆发酵45 d以后，其他各组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素、木质素含量均显著降低(P<0.05)。CS组的DM、CP、NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量显著高于CK组(P<0.05)。与CK组相比，CPL组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素、木质素含量差异不显著(P>0.05)，CPLP和CPLB组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量均显著降低(P<0.05)。

2.2　青贮玉米秸秆的发酵品质

由表3可以看出，各组玉米秸秆发酵后，pH均在4.2以下。与CK组相比，CPL组的NH3-N/TN和乳酸/乙酸均显著降低(P<0.05)，乳酸含量差异不显著(P>0.05)；CPLB组的乳酸含量显著增加(P<0.05)，CPLP和CPLB组的NH3-N/TN和乳酸/乙酸均显著降低(P<0.05)。各组均未检测到丙酸和丁酸。

表2　酶-菌制剂对青贮玉米秸秆营养成分的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3　酶-菌制剂对青贮玉米秸秆发酵品质的影响

2.3　青贮玉米秸秆的微观结构

2.3.1一级结构——聚合度

由表4可以看出，玉米秸秆发酵后，纤维素的聚合度具有差异性。CS组的聚合度显著高于CK组(P<0.05)。与CK组相比，CPL组的聚合度无显著差异(P>0.05)；CPLP、CPLB组的聚合度分别显著降低了38.92%、35.64%(P<0.05)。

表4　酶-菌制剂对青贮玉米秸秆聚合度的影响

2.3.2二级结构——氢键作用力

1.玉米秸秆组(CS组)；2.青贮对照组(CK组)；3.复合酶制剂组(CPL组)；4.复合酶-单活菌组(CPLP组)；5.复合酶-双活菌组(CPLB组)。下图同。

1. corn stalk group (CS group)；2. corn silage group (CK group)；3. compound enzyme preparation group (CPL group)；4. compound enzyme preparation+single live bacteria group (CPLP group)；5. compound enzyme preparation+double live bacteria group (CPLB group). The same as below.

图1酶-菌制剂对青贮玉米秸秆FTIR图谱的影响

Fig.1Effects of enzyme-bacterial preparation on FTIR spectra of silage corn stover

2.3.3三级结构——结晶度(XRD衍射)

由表5可以看出，经过发酵以后，玉米秸秆的结晶度具有增加的趋势。结晶度从大到小依次为CPL组>CPLB组>CPLP组>CK组>CS组。玉米秸秆的XRD图谱如图2所示。CPL、CPLP和CPLB组的101、002和004处晶面的衍射峰变宽，衍射强度明显增强，说明秸秆青贮后结晶度发生了改变。

表5　酶-菌制剂对青贮玉米秸秆结晶度的影响

图2　酶-菌制剂对青贮玉米秸秆XRD图谱的影响

2.3.4四级结构——比表面积

纤维素的比表面积是表征纤维素微纤丝与纤维素降解酶分子间可接触面积大小的参量，对微生物及纤维素降解酶的可及性均有较大的影响[10]。由表6可以看出，玉米秸秆发酵以后，与CK组相比，CPL组的比表面积无显著差异(P>0.05)，CPLP和CPLB组的比表面积显著增加(P<0.05)，但是变化范围不大，其中CPLP组比表面积增加的最多。