白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-解偶联蛋白2信号通路降低小鼠睾丸间质细胞TM3的氧化损伤

2018-07-16张晓春陈指龙伍小松

动物营养学报 2018年7期

张晓春　陈指龙　方　娟　黎　陈　伍小松　杨　青*

(1.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128；2.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128)

当机体遭受体内外各种有害刺激时，由于机体内氧化系统与抗氧化系统平衡失调，机体内活性氧(ROS)会大量聚集，使组织细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物，从而引起细胞的氧化损伤。研究发现氧化损伤可引起动物严重的生精障碍，导致睾丸组织发生明显的病理变化，睾丸指数和精子数下降，精子畸形率升高，造成雄性动物不育[1-2]。白藜芦醇(RES)是一种广泛存在于葡萄、花生、虎杖、决明、藜芦等植物性食物中的天然多酚类物质，具有很广泛的生物学活性，在治疗氧化损伤、炎症、过敏、肿瘤、心血管疾病等方面都得以应用[3-4]。目前，RES在畜禽生产中也被广泛应用，它能提高畜禽的生产性能、改善畜禽酮体品质和肉品质、提高畜禽免疫力和抗氧化能力[5]。高糖高胆固醇饮食可导致小鼠睾丸间质细胞的睾酮合成能力受损，添加RES能够通过减轻其氧化应激，并通过激活沉默调节蛋白1(SIRT1)及影响下丘脑-垂体-性腺轴的调控发挥保护作用[6]。成海建等[7]研究发现RES可通过激活SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路促进牛皮下脂肪细胞的凋亡。周曦等[8]研究发现RES可能通过调控SIRTl/解偶联蛋白2(UCP-2)信号通路抑制血管内皮细胞氧化应激损伤。SIRT1具有去乙酰化酶活性，通过对组蛋白、多种转录因子、转录共调控因子的翻译后修饰(去乙酰化)，可调节与氧化应激、凋亡、炎症反应相关基因和蛋白质的转录[9]。UCP2作为解偶联蛋白，能影响线粒体的跨膜电位，当线粒体内膜电势升高时，UCP2能够降低细胞膜内外氢离子(H+)浓度，促进氧消耗，从而抑制ROS的产生[10]。目前，虽已明确RES的抗氧化作用效果，但对于其具体的作用机制尚未完全明确。因此，本研究以小鼠睾丸间质细胞TM3为研究对象，在过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激状态下研究RES对氧化损伤细胞的治疗作用，并阐明其可能的作用机制，以期为防治由氧化损伤引起的雄性生殖系统疾病提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.2　试验方法

1.2.1细胞培养

小鼠睾丸间质细胞TM3细胞株用DMEM/F12培养基(添加10%的胎牛血清和1%青-链霉素)，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每天更换培养基，待细胞长至对数生长期即汇合度达到80%～90%时，使用胰酶消化制备细胞悬液。

1.2.2iCELLigence细胞功能分析仪监测细胞增殖情况

将细胞消化离心后，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞并计数，制备成密度为2.5×104个/mL的细胞悬液待用。在E-Plate L8板中加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基(150 μL/孔)，放入iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪(Roche，德国)，在仪器配备的iPad软件中，选择增殖试验，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基自动调零。随后取出E-Plate L8板，每孔加入细胞悬液300 μL，每组设置3个重复孔，待细胞静置30 min后将E-Plate L8板重新放置于iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪内，点击开始进行实时监测。具体操作过程中：1)在确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度的试验中，待细胞生长曲线进入对数期后(即在培养板中培养24 h后)，将E-Plate L8取出，轻轻吸出100 μL培养基，再加入100 μL含不同浓度H2O2的培养基，使终浓度分别0(正常对照组)、150、200、250和300 μmol/L，轻轻混匀后再将E-Plate L8板置于分析仪中，继续监测8 h，此过程共监测32 h。2)在确定RES安全浓度的试验中，待细胞生长曲线进入对数期后(即在培养板中培养24 h后)，将E-Plate L8取出，分别采用0(正常对照组)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理，继续监测24 h，此过程共监测48 h。3)在RES干预处理氧化损伤细胞的试验中，待细胞生长曲线进入对数期后(即在培养板中培养24 h后)，先将细胞用150 μmol/L的H2O2处理8 h，再分别用0(H2O2组)、2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理，同时设未经H2O2和RES处理的正常对照组，继续监测24 h，此过程共监测56 h。设置iCELLigence系统每隔15 min实时监测细胞增殖情况，制作增殖曲线，不同曲线可反映不同处理条件下细胞实时增殖情况，细胞增殖情况用增殖指数(proliferation index，PI)表示。在监测结束时测定各个培养板中细胞的存活率。

1.2.32′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞中ROS含量

待RES(5.0 μmol/L)处理氧化损伤细胞结束后，按照ROS检测试剂盒说明书测定细胞中ROS含量，具体操作如下：去掉培养上清液，加入含10 μmol/L DCFH-DA探针的新鲜培养基，37 ℃孵育细胞40 min，用胰酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗1次，离心留细胞沉淀，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为6×105个/mL，使用荧光酶标仪在激发波长为485 nm、发射波长为525 nm处检测荧光强度。DCFH-DA本身没有荧光，当其进入细胞后被酯酶水解为DCFH，而DCFH可被细胞内的ROS氧化为强绿色荧光物质DCF，因此，其荧光强度与细胞内ROS的含量成正比，可用荧光强度表示ROS含量。

1.2.4实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)检测细胞中SIRT1和UCP2的mRNA相对表达量

表1　实时荧光定量PCR引物序列

F和R分别代表上游和下游引物。

F and R represent forward and reverse primers, respectively.

1.2.5蛋白质印迹(Western-blot)法检测细胞中SIRT1和UCP2的蛋白质相对表达量

待RES处理氧化损伤细胞结束后，弃掉培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入200 μL RIPA细胞裂解液(含1% PMSF)，吹打均匀，冰上放置30 min，期间剧烈振荡3次，每次30 s，将细胞裂解液置于4 ℃，12 000 r/min离心10 min后吸取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质浓度的测定。取适量蛋白质样品用5 Loading Buffer混匀，100 ℃水浴中煮5 min使蛋白质变性。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，每孔上样量为30 μg，然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用0.2%明胶室温摇床封闭1 h，分别加入不同的一抗4 ℃孵育过夜；用三羟甲基氨基甲烷吐温(TBST)洗膜3次，每次10 min；加入相对应的HRP标记二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后用ECL化学发光液进行显色，于ChemiDocTMXRS+成像系统中检测蛋白质条带并用Quantity One软件分析条带的密度值和表达量，以β-actin为内参。

1.3　数据统计分析

试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0统计分析软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行方差分析，采用LSD法进行两两比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2　结果与分析

2.1　H2O2对TM3细胞增殖的影响

不同浓度H2O2处理TM3细胞8 h后，根据iCELLigence细胞功能分析仪实时监测结果(图1)可知，与正常对照组相比，各浓度H2O2组的细胞存活率均极显著下降(P<0.01)，且呈浓度依赖。其中用150 μmol/L的H2O2处理时细胞存活率下降至75%左右，达到预计的损伤效果。因此，在后续试验中选用150 μmoL/L的H2O2处理细胞8 h构建本试验中所需的氧化损伤细胞模型。

A：iCELLigence细胞功能分析仪实时监测H2O2对TM3细胞增殖的影响。B：不同浓度H2O2处理TM3细胞8 h后对细胞增殖的影响。

A： real-time monitor the effect of H2O2on proliferation of TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of different concentrations of H2O2on proliferation of TM3 cells after treated for 8 h.

数据柱标“**”表示与正常对照组相比差异极显著(P<0.01)。下图同。

Value columns of each with “**” mean extremely significant difference compared with the normal control group (P<0.01). The same as below.

图1不同浓度H2O2对TM3细胞增殖的影响

Fig.1Effects of different concentrations of H2O2on proliferation of TM3 cells

2.2　RES对TM3细胞增殖的影响

为研究RES对H2O2致TM3细胞氧化损伤的作用效果，首先检测了RES对TM3细胞增殖的影响，由图2可知，用浓度分别为2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理正常细胞24 h后，各浓度RES组与正常对照组的细胞存活率无显著差异(P>0.05)。由图3可知，当用RES处理氧化损伤细胞24 h后，与H2O2组(仅经H2O2单独处理，未经RES处理的氧化损伤细胞)相比，各浓度RES组的细胞存活率均显著提高(P<0.05)，但仍无法恢复到正常对照组水平，且各浓度RES组间无显著差异(P>0.05)，因此，后续试验中选取浓度为5 μmol/L的RES对氧化损伤TM3细胞进行处理。

2.3　RES对氧化损伤TM3细胞中ROS含量的影响

由图4可知，正常细胞经H2O2的处理后，细胞内相对荧光强度极显著增强(P<0.01)，即表明细胞中ROS含量显著升高；而氧化损伤细胞经RES处理后，细胞内相对荧光强度极显著下降(P<0.01)，但仍无法恢复至正常对照组的水平。这说明RES能够在一定程度上抑制氧化损伤TM3细胞中ROS的产生。

A：iCELLigence细胞功能分析仪实时监测RES对TM3细胞增殖的影响。B：不同浓度RES处理TM3细胞24 h后对细胞增殖的影响。

A： real-time monitor the effects of RES on proliferation of TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of different concentrations of RES on proliferation of TM3 cells after treated for 24 h.

图2不同浓度RES对TM3细胞增殖的影响

Fig.2Effects of different concentrations of RES on proliferation of TM3 cells

A：iCELLigence细胞功能分析仪实时监测RES对H2O2诱导氧化损伤TM3细胞增殖的影响。B：RES处理24 h对H2O2诱导氧化损伤TM3细胞增殖的影响。

A： real-time monitor the effects of RES on proliferation of H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells by iCELLigence cell function analyzer. B： effects of RES on proliferation of H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells after treated for 24 h.

数据柱标注“#”表示与H2O2组相比差异显著(P<0.05)。

Value columns with “#” mean significant difference compared with H2O2group (P<0.05).

图3RES对H2O2诱导氧化损伤TM3细胞增殖的影响

Fig.3Effects of RES on proliferation of oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

2.4　RES对氧化损伤TM3细胞中SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质相对表达量的影响

由图5-A可知，正常细胞经H2O2的处理后，细胞中SIRT1 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)，UCP2 mRNA相对表达量极显著增加(P<0.01)。而氧化损伤细胞经RES处理后，细胞中SIRT1 mRNA相对表达量极显著增加(P<0.01)，UCP2 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)。由图5-B可知，细胞中SIRT1和UCP2蛋白质相对表达量的变化趋势与其mRNA相对表达量变化趋势一致，即H2O2处理导致SIRT1蛋白质相对表达量极显著降低(P<0.01)，而使UCP2蛋白质相对表达量表达极显著增加(P<0.01)；RES处理可极显著提高氧化损伤细胞中SIRT1蛋白质相对表达量(P<0.01)，显著降低UCP2蛋白质相对表达量(P<0.05)。

3　讨　论

3.1　H2O2诱导TM3细胞氧化损伤模型的建立

目前，在细胞氧化损伤模型的建立中，多以H2O2作为诱导剂，不同类型的细胞对诱导剂的敏感性不一样，因此诱导剂的浓度和处理时间非常关键[11-12]。当诱导剂浓度过高或处理时间过长时会导致细胞损伤太严重，不利于抗氧化机制的研究；而当损伤程度太弱时，细胞可能通过自身修复影响相关的研究。对于细胞氧化损伤模型，一般通过噻唑蓝(MTT)法检测，根据其吸光度值来判断细胞增殖情况从而确定氧化损伤程度，MTT法虽然有其优势，如重复性较好、特异性强等，但每次只能确定1个时间点细胞的增殖情况。本试验中采用iCELLigence细胞功能分析仪实时监测，可更直观地判断细胞的增殖情况，而且监测过程中不需要特殊试剂，可减少因多次操作所导致的误差。本试验中，通过iCELLigence细胞功能分析仪实时监测，发现150 μmol/L的H2O2处理细胞8 h，细胞存活率下降至75%左右，符合后续抗氧化损伤试验的要求，因此确定采用150 μmol/L的H2O2建立细胞氧化损伤模型。

数据柱标注“##”表示与H2O2组相比差异极显著(P<0.01)。下图同。

Value columns with “##” mean extremely significant difference compared with H2O2group (P<0.01). The same as below.

图4RES对H2O2诱导氧化损伤TM3细胞中ROS含量的影响

Fig.4Effects of RES on ROS content in oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

A：qPCR检测RES对H2O2诱导氧化损伤TM3细胞中SIRT1和UCP2 mRNA相对表达量的影响。B：Western-blot法检测RES对H2O2诱导氧化损伤TM3细胞中SIRT1和UCP2蛋白质相对表达量的影响。

A：detection of the mRNA relative expression levels ofSIRT1 andUCP2 in H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells with treatment of RES by qPCR. B： detection of the protein relative expression levels of SIRT1 and UCP2 in H2O2-induced oxidative-damaged TM3 cells with treatment of RES by Western-blot method.

同行数据肩标“**”表示与正常对照组相比差异极显著(P<0.01)，肩标“##”表示与H2O2组相比差异极显著(P<0.01)，肩标“##”表示与H2O2组相比差异显著(P<0.05)。

Values in the same line with “**” superscript means extremely significant difference compared with the normal control group (P<0.01)， with “##” superscript means extremely significant difference compared with the H2O2group (P<0.01)， and with “#” superscript means significant difference compared with the H2O2group (P<0.05).

图5RES对H2O2氧化损伤TM3细胞中SIRT1和UCP2mRNA及蛋白质相对表达量的影响

Fig.5Effects of RES on mRNA and protein relative expression levels ofSIRT1 andUCP2 in oxidative-damaged TM3 cells induced by H2O2

3.2　RES对氧化损伤细胞的保护作用

研究表明，动物体中90%的ROS源于线粒体电子呼吸传递链，ROS的产生与线粒体能量代谢紧密相关，当ROS含量增加时，会对线粒体的结构、功能造成损伤，而线粒体受到损伤后又会促进ROS的生成，如此恶性循环，加重氧化损伤程度[13-14]。解偶联蛋白(UCPs)是位于线粒体内膜上的一类转运蛋白，它们可以介导线粒体内膜的“质子漏”使能量以热的形式散失[15]。UCP2作为UCPs家族成员之一，是UCPs在生殖系统中的主要存在形式[16-17]。大量试验表明，UCP2可以调控ROS的生成，并参与多种组织的抗氧化损伤作用。Brand[18]提出了UCP2对ROS的负调控假设模型，当ROS含量增加时，过氧化物在化学转化过程中产生的某种物质激活UCP2的质子漏活性，导致线粒体膜电位的下降，UCP2就以一种负反馈调节的方式来限制ROS的生成，表明在氧化应激过程中，UCP2可以通过降低ROS的生成量保护机体免受过氧化损伤。同样的结论在Zhang等[19]、王晓娜等[20]的试验中也得到证实。Zhang等[19]的试验表明，高温诱导的凋亡能引起小鼠睾丸内ROS含量增加，UCP2蛋白质表达量也随之增加；王晓娜等[20]试验发现，精子内UCP2蛋白质的表达量与过氧化氢的作用浓度呈正相关，UCP2为了对抗增加的ROS，表达量也随之增加。SIRT1作为一种核蛋白，能够以转录的形式抑制UCP2的转录活性，通过与UCP2启动子结合，抑制UCP2基因的表达，减少其编码的线粒体内膜蛋白的生成，从而抑制线粒体中解偶联反应的发生[21]。相关研究表明，经不同药物诱导的大鼠或小鼠氧化应激模型中，SIRT1都表现出低表达状态，而SIRT1一经激活，可导致UCP2的表达下降[8,22-23]。结合以上信息推测，在本试验中，RES通过对SIRT1/UCP2信号通路的调节发挥对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用。

本试验结果显示，与正常对照组相比，H2O2组细胞中ROS含量极显著增加，SIRT1 mRNA及蛋白质的相对表达量均极显著降低，而UCP2 mRNA及蛋白质的相对表达量极显著升高，提示细胞被H2O2损伤后细胞中SIRT1含量的降低可能诱导UCP2含量的增加，以抵抗细胞中增加的ROS。UCP2生成量增加，解偶联线粒体内氧化磷酸化过程，减少ATP的生成，ROS的生成量应该下降，但氧化应激在细胞中UCP2表达增强的情况下仍持续存在，推测可能是由于UCP2增加的量不足以抵抗ROS的过量产生。相比氧化损伤细胞，采用RES处理后由H2O2所致的SIRT1 mRNA及蛋白质表达的下调和UCP2 mRNA及蛋白质表达的上调均在一定程度上受到抑制，且细胞中ROS含量也极显著下降，提示RES作为SIRT1的激活剂，能够促进其表达。SIRT1被激活后，可抑制UCP2的表达，理论上应该会产生更多的ROS，但实际采用RES处理后氧化损伤细胞中ROS的含量相对未经RES处理的氧化损伤细胞而言是减少的，分析原因可能是UCP2对ROS存在负反馈调节，即UCP2表达被抑制后，细胞中ROS的含量增加，UCP2通过负反馈调节的方式限制ROS的产生。

此外，在本研究中发现，在正常TM3细胞中UCP2 mRNA的表达较丰富，而其蛋白质较难检测到，而经H2O2损伤后TM3细胞中UCP2蛋白质的相对表达量极显著增加。这种情况的出现可能与抗体的特异性有关；也可能是在生理状态下，某些器官中的UCP2 mRNA并不最终表达为蛋白质，而在病理状态下就可以启动UCP2 mRNA翻译为蛋白质。在Fisler等[24]的研究中也在胰腺、脾脏、心脏、下丘脑、肺、睾丸、巨噬细胞等检测到大量的UCP2 mRNA，而用Western blot法仅在下丘脑、巨噬细胞、白色脂肪组织、脾脏、胰岛的实质细胞中检测到了UCP2蛋白质。