凡纳滨对虾幼虾饲料中适宜钙和磷添加水平

2018-07-16安文强陈效儒黎文伟董晓慧谭北平

动物营养学报 2018年7期

安文强　陈效儒　黎文伟*　董晓慧**　谭北平　赵　鑫

(1.广东海洋大学水产动物营养与饲料实验室，湛江 524088；2.通威股份有限公司，成都 610041)

钙是甲壳动物机体重要的组成成分，除了构成体壳，还参与肌肉收缩、血液凝固、神经传递、调节渗透压、激活酚氧化酶(PO)原系统以及维持细胞膜的完整性和通透性[1-2]。磷是动物细胞核酸及细胞膜的重要成分，同时又直接影响所有细胞的能量反应，对动物的生长、骨骼的矿化有极大的作用，缺乏磷会抑制对虾的生长[3]。

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又称南美白对虾，是世界三大主养虾类之一。目前国内外对凡纳滨对虾幼虾的蛋白质、氨基酸、脂肪、生物素、维生素等营养物质的需求量已进行了研究，但关于凡纳滨对虾幼虾矿物质的需求量研究主要集中在钙、镁、铬等[5]少数几种，对钙、磷需求量的研究尚缺乏。Deshimaru等[6]发现日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)在饲料中无需添加钙，仅需添加2%的磷就可满足其生长需求；而Kanazawa等[7]却发现饲料磷的添加水平应为1%。中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)投喂含0.91%的磷、2.2%的钙的饲料时有最佳生长性能[8]。斑节对虾(Penaeusmonodon)饲料中钙水平为1.25%时，添加1.0%～1.5%的磷生长最佳[9]。印度对虾(Penaeusindicus)饲料中钙水平为1.25%、磷水平为1.32%时可获得最佳生长性能[10]。Davis等[11]在海水中对凡纳滨对虾的研究发现，在不额外添加钙时，基础饲料中0.35%的磷便能维持对虾的生长和存活，若添加1%和2%的钙，则需分别添加0.5%～1.0%和1.0%～2.0%的磷才能维持对虾的正常生长；而Cheng等[12]在低盐度水体对凡纳滨对虾试验发现，当添加2%的钙时其生长受到抑制，表明钙的添加水平应小于磷的添加水平。但同时考察凡纳滨对虾幼虾饲料中钙、磷的适宜添加水平的研究尚未报道。

饲料中过高的钙和磷水平会增加对虾向周围水环境的矿物质排泄，造成水体污染。有研究建议把饲料中钙/磷当成一个独立的矿物质水平指标来看待[13]，要在满足对虾的生长需求的情况下尽量控制钙和磷的添加。近年来由于鱼粉价格居高不下，商品饲料中植物蛋白质原料替代鱼粉的比例逐渐升高，鱼粉中磷水平通常在1.5%～2.5%，植物性蛋白质源中的磷有40%～90%以植酸磷的形式存在，很难能被水产动物利用，这使得对虾商品饲料中钙和磷的水平不断降低[14]。本试验在商品基础饲料基础上，通过研究不同钙和磷添加水平对凡纳滨对虾幼虾生长性能、体成分、组织钙和磷水平、血清指标的影响，确定凡纳滨对虾幼虾饲料中适宜的钙和磷添加水平，结果可为凡纳滨对虾高效配合饲料的生产提供基础数据。

1　材料与方法

1.1　试验饲料和试验设计

以鱼粉、虾壳粉、豆粕、花生粕和玉米蛋白粉为蛋白质源，鱼油、豆油和大豆卵磷脂为脂肪源，面粉为糖源，配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。

在基础饲料的基础上，以乳酸钙(国药集团化学试剂有限公司)为钙源、磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司)为磷源，在钙添加水平分别为0、0.50%、1.00%条件下，分别添加0、0.40%、0.80%、1.20%、1.60%的磷，制成15种试验饲料。饲料原料粉碎过80目筛，并按配方准确称取，采用逐级扩大法混合，第1次混合15 min后，加鱼油、大豆油和大豆卵磷脂，然后混匀，过80目筛，加入蒸馏水(30%，V/m)，再混合均匀，压制成直径分别为1.0和1.5 mm的颗粒饲料，60 ℃熟化30 min，风干后编号分装，-20 ℃保存备用。

表1　基础饲料组成及营养水平(风干基础)

1)每千克维生素预混料含有Contained the following per kg of vitamin premix:维生素A醋酸酯 retinyl acetate 10.00 g，VD350.00 g，VE 99.00 g，VK 5.00 g，VB125.50 g ，VB225.00 g，VB650.00 g，VB120.10 g，泛酸钙 calcium pantothenate 61.00 g，烟酸nicotinic acid 101.00 g，生物素biotin 25.00 g，肌醇inositol 153.06 g，叶酸folic acid 6.25 g，纤维素cellulose 389.09 g。

2)每千克矿物质预混料含有Contained the following per kg of mineral premix:KIO340.03 g，CoCl2·6H2O 4.07 g，CuSO4·5H2O 19.84 g，FeC6H5O713.71 g，ZnSO4·7H2O 28.28 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，MnSO4·H2O 12.43 g，KCl 15.33 g，Na2SeO32.00 g，沸石粉zeolite power 864.19 g。

1.2　试验用虾及饲养管理

养殖试验在广东省湛江市东海岛广东海洋大学海洋生物研究基地室内海水养殖系统中进行，凡纳滨对虾幼虾购于湛江市东海岛中联虾苗厂。幼虾购回后，在室外水泥池中标粗至所需规格。正式试验开始前，投喂基础饲料1周，使对虾适应饲料。根据试验设计，共设15组，每组3个重复，每重复1个0.30 m3的玻璃钢桶。对虾停喂24 h后，挑选出规格均匀、健壮、活力强的对虾[初重(0.38±0.01) g]，随机分配于玻璃钢桶中，每桶放40尾虾，养殖期8周。每天投喂4次(07:00、11:00、17:00、21:00)，表观饱食投喂，投喂1 h后检查剩料，根据对虾摄食情况及天气情况调整投喂量。养殖期间不间断充氧。对虾养殖前2周每2 d换水1次，后6周每天换水1次。试验期间水温28～31 ℃，盐度21～24，pH 7.8～8.2，溶氧浓度≥5 mg/L，氨氮浓度<0.2 mg/L，亚硝酸盐浓度<0.05 mg/L。

1.3　样品采集与测定

1.3.1样品采集

试验结束禁食24 h后称重、计数，计算生长指标。然后每桶随机取15尾虾，逐尾用1 mL注射器从第5步足基部血窦采集血液，合并置于Eppendorf管中，4 ℃保存过夜，以3 000 r/min离心10 min后收集血清，-80 ℃保存备测血清指标。另每桶取10尾虾沥干水分后装于封口袋中，剩余的对虾剥离虾壳和肌肉，-20 ℃保存，备测常规成分。

1.3.2饲料、全虾及肌肉常规成分分析方法

饲料、全虾及肌肉样品的水分测定采用105 ℃烘干恒重法，粗蛋白质(CP)含量测定采用凯氏定氮法(KjeltecTM8400，瑞典)，粗脂肪(CL)含量测定采用索式抽提法(抽提剂为石油醚)，粗灰分(Ash)含量测定采用马弗炉550 ℃灼烧法。

1.3.3饲料、全虾、肌肉和虾壳的钙和磷水平分析方法

样品烘干磨粉后，将样品置放于具塞试管中加入5 mL默克硝酸，70 ℃水浴消化2 h，然后在消化炉上赶酸5 h，加入1 mL双氧水，赶酸至剩下1 mL稀释。最后用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定钙和磷水平。

1.3.4血清指标分析方法

碱性磷酸酶(ALP)活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定；PO活性参照Huang等[15]的方法测定；胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、钙离子(Ca2+)和无机磷(IP)含量利用全自动生化分析仪(日立7020HITACHI，日本)检测。

1.3.5生长指标的计算

增重率(WGR，%)=[(末均重-
初均重)/初均重]×100；
特定生长率(SGR，%/d)=[(ln末均重-
ln初均重)/饲养天数]×100;
蛋白质效率(PER)=(终末体重-初始体重)/
(饲料摄入量×饲料CP含量);
饲料系数(FCR)=摄食饲料干重/
(终末体重-初始体重);
成活率(SR，%)=(试验结束时虾尾数/
试验开始时虾尾数)×100。

1.4　数据处理

数据采用SPSS 17.0对数据进行双因素方差分析，若存在显著性差异，再采用Duncan氏法进行多重比较，检验组间的差异显著性。试验结果用“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2　结　果

2.1　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾生长性能的影响

凡纳滨对虾生长性能结果见表2。饲料钙添加水平对WGR、SGR、PER和FCR有极显著影响(P<0.01)，对SR没有显著影响(P>0.05)。饲料磷添加水平对WGR、SGR、PER和FCR有极显著影响(P<0.01)。WGR和SGR随着饲料磷添加水平的升高而升高，但0.80%～1.60%水平之间没有显著性差异(P>0.05)。PER随着饲料磷添加水平的提高先升高后降低，在0.80%磷添加水平达到最大，显著高于其他水平(P<0.05)。FCR随着饲料磷添加水平的提高先降低后升高，在0.80%磷添加水平时有最小的FCR。除1.2%外，其他磷添加水平均显著地提高了SR(P<0.05)。饲料钙添加水平与磷添加水平的交互作用极显著地影响WGR、SGR、FER和FCR(P<0.01)，对SR无显著性影响(P>0.05)。

以SGR为判断依据，通过二次回归曲线和折线模型分析得出：饲料中不添加钙时，饲料中可添加1.17%的磷；添加0.50%的钙时，饲料中可添加1.00%的磷；添加1.00%的钙时，饲料中可添加1.26%的磷。对虾在添加1.00%的钙和1.26%的磷时有最大SGR(图1)。

表2　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾生长性能的影响

同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

图1　3个钙添加水平下凡纳滨对虾饲料中磷的最适添加水平

2.2　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾全虾及肌肉常规成分的影响

凡纳滨对虾全虾及肌肉常规成分的结果见表3。饲料钙添加水平极显著地影响肌肉CP、CL、Ash的含量(P<0.01)，显著影响全虾CL、Ash的含量(P<0.05)，对全虾CP含量的影响不显著(P>0.05)。磷添加水平极显著地影响全虾CP、CL含量和肌肉CP、CL、Ash含量(P<0.01)，对全虾Ash的含量没有显著影响(P>0.05)。饲料钙添加水平与磷添加水平的交互作用极显著地影响全虾CL含量和肌肉CP、CL、Ash含量(P<0.01)，对全虾CP、Ash的含量影响不显著(P>0.05)。

饲料中添加不同水平的钙显著提高了全虾Ash含量和肌肉CP含量(P<0.05)，显著降低了全虾CL含量和肌肉CL、Ash含量(P<0.05)。

全虾和肌肉CP含量随着磷添加水平的提高逐渐增加然后趋于稳定。饲料中添加1.60%的显著降低了全虾CL含量(P<0.05)，饲料中添加不同水平的磷显著地降低了肌肉CL的含量(P<0.05)，饲料中添加0.80%～1.60%的磷显著提高了肌肉Ash含量(P<0.05)。

表3　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾全虾及肌肉常规成分的影响(干物质基础)

2.3　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾组织钙和磷水平的影响

凡纳滨对虾组织钙和磷水平的结果见表4。饲料钙和磷添加水平及其交互作用均极显著地影响全虾、肌肉和虾壳的钙和磷水平(P<0.01)。饲料中添加不同水平的钙显著地提高了全虾的钙和磷水平和虾壳的钙水平(P<0.05)，显著降低了肌肉的钙水平(P<0.05)。随着饲料钙添加水平的提高肌肉磷水平先降低再升高，钙添加水平为1.00%时达到最高，并各水平间存在显著性差异(P<0.05)。对虾全虾的钙和磷添加水平、肌肉和虾壳的钙水平随着饲料磷水平的提高均呈先增加后减少趋势。随着磷添加水平的提高，肌肉的磷添加水平持续增加，而虾壳的磷水平逐渐增加后趋于稳定。

表4　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾组织钙和磷水平的影响

2.4　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾血清指标的影响

凡纳滨对虾血清指标的结果见表5。饲料钙添加水平极显著影响血清ALP和PO的活性及Ca2+的含量(P<0.01)，对CHOL、TG和IP的含量影响不显著(P>0.05)。饲料磷添加水平极显著地影响血清ALP、PO的活性和CHOL、TG、IP的含量(P<0.01)，显著地影响Ca2+的含量(P<0.05)。饲料钙添加水平与磷添加水平的交互作用极显著地影响血清ALP的活性和Ca2+、IP的含量(P<0.01)，显著地影响TG的含量(P<0.05)，对PO的活性、CHOL的含量无显著性影响(P>0.05)。

饲料中添加不同水平的钙，显著地提高了血清ALP、PO的活性和降低了Ca2+的含量(P<0.05)。饲料中添加不同水平的磷，显著降低了血清ALP的活性和CHOL、TG的含量(P<0.05)，但0.80%～1.60%水平之间的ALP活性无显著差异(P>0.05)，0.40%和0.80%、1.20%和1.60%水平之间的TG含量也无显著性差异(P>0.05)。血清PO的活性随着饲料磷添加水平的提高先升高后下降，在0.40%水平达到最大值。饲料中添加不同水平的磷显著升高了血清Ca2+和IP的含量(P<0.05)，但0.40%～1.60%水平之间均无显著性差异(P>0.05)。

表5　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾血清指标的影响

3　讨　论

3.1　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾生长性能的影响

Davis等[11]研究发现，若不添加钙，基础饲料中含0.35%的磷就可以维持凡纳滨对虾的生长和存活；若添加1%钙，则添加2%的磷时对虾有最大的WGR和SR。Cheng等[12]报道盐度为2的水体中养殖的凡纳滨对虾在无钙饲料中，添加0.77%的有效磷(0.93%总磷)就能满足其生长；当添加1%的钙时，饲料中需添加1.22%的有效磷(2%的总磷)，凡纳滨对虾才具有较好的生长性能。本试验结果发现，饲料钙和磷添加水平及二者的交互作用均显著影响凡纳滨对虾的WGR、SGR、PER和FCR；同一饲料钙添加水平下，对虾不添加磷的组别的WGR、SGR和PER都显著低于其他各组，不添加钙和磷的基础饲料组的SR显著低于其他各组。这与Davis等[11]和Cheng等[12]的研究结果一致。对虾能吸收水体中的矿物质，但水体中磷水平很少，远远不能满足对虾的生长要求，所以必须在饲料中添加磷。本试验中随着饲料磷添加水平的提高，对虾的WGR、SGR和PER均升高，这与凡纳滨对虾[16]、斑节对虾[9]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[18]和军曹鱼(Rachycentroncanadum)[19]的研究结果一致；而Peaflorida[20]研究发现，在不添加钙，添加0.5%的磷时斑节对虾有最大的WGR和SR；随着饲料磷水平的升高，斑节对虾的WGR和SR远低于对照组。Ambasankar等[9]在研究不同磷水平对斑节对虾的生长性能影响时发现，钙水平1.25%的饲料中，1.5%的磷使对虾有最大的WGR和SR；而磷水平为2.5%时，对虾的SR最低。这些结果表明，饲料磷水平过高会出现的磷抑制对虾生长。Roy等[21]和Shao等[22]分别在黑线鳕鱼(Melanogrammusaeglefinus)和黑鲷(Sparusmacrocephlus)幼鱼试验中得到了同样的结果。本试验中凡纳滨对虾幼虾没有出现过量磷抑制生长的现象，可能与对虾幼期生长速度快，蜕壳次数多，需要较多的磷有关。Niu等[23]在研究凡纳滨对虾仔虾期的磷需要量时也发现对虾在早期需要更高的磷。

对虾生长、蜕壳需要大量的钙和磷，而一般情况下对虾能通过腮和消化道上皮从养殖水体中吸收足够的钙，所以通常认为对虾饲料中并不需要额外添加钙，只需要添加磷便能满足对虾的生长[24]。饲料中钙水平会影响对虾对磷的吸收利用，当饲料钙过量时，Ca2+与磷酸根结合形成磷酸钙从而影响磷的消化吸收[25]。Davis等[26]研究表明，对虾饲料中的钙水平不能超过3%。Cheng等[12]的试验也得到了类似结果。本试验的饲料钙水平为1.62%～2.70%，与Davis等[26]和Cheng等[12]建议的饲料钙水平相符。

3.2　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾全虾及肌肉常规成分的影响

3.3　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾组织钙和磷水平的影响

鱼虾机体的钙和磷水平，常常作为研究鱼虾饲料钙和磷适宜添加水平的一个参考指标[25,34]。本试验中，饲料中添加钙和磷均提高了凡纳滨对虾全虾和虾壳的钙和磷水平。克原氏螯虾[30]和中华绒螯蟹[32]的研究发现，全虾和全蟹的磷水平随着饲料磷水平的提高而增加。黄凯等[35]研究发现，饲料中添加的磷酸二氢钙对凡纳滨对虾全虾钙水平及甲壳钙水平与磷水平均有显著的影响；红螯螯虾全虾和甲壳磷水平随饲料磷水平的提高而增加[2]；中国对虾饲料钙水平与虾壳钙水平之间，饲料磷水平与虾壳磷水平及肌肉磷水平之间呈线性关系[33]；Pan等[16]在凡纳滨对虾饲料中添加不同水平的磷酸二氢钙，发现全虾和甲壳的钙和磷水平均受到饲料钙和磷水平的影响；凡纳滨对虾全虾、虾壳的钙和磷水平与饲料中钙和磷的水平呈正相关联系[13]；胡王龙[30]研究发现，黑鲷全鱼钙和磷水平随饲料磷水平的升高而增加。Watanabe等[36]、Shearer等[37]、Cain等[38]、Ketola[39]和Bureau等[40]的研究中也证实了鱼体钙和磷水平与饲料磷水平之间存在正相关的关系。但Peaflorida[21]研究发现，印度对虾全虾磷水平与饲料磷水平无关。Davis等[41]研究表明，饲料钙和磷水平与对虾组织矿物元素含量没有直接相关性；日本囊对虾[42]、美洲螯龙虾(Homarusamericanus)[43]等研究中也有类似的报道。这可能与虾生长过程中的蜕皮周期有关，因为甲壳动物蜕皮前后甲壳和肌肉中钙和磷水平都会有相应变化[43]。

3.4　饲料钙和磷添加水平对凡纳滨对虾血清指标的影响

ALP是一种磷酸单酯酶，可催化磷酸的水解反应及基团的转移反应，为二磷酸腺苷(ADP)磷酸化形成三磷酸腺苷(ATP)提供无机磷酸[44]。红螯螯虾研究中发现随着饲料磷水平的升高，肝脏ALP活性降低，当总磷水平为1.74%时活性最低[2]。Cheng等[12]在凡纳滨对虾研究中也发现肝脏ALP活性随着饲料磷水平(0.5%～2%)的增加而显著降低。本试验随着饲料磷添加水平的升高，凡纳滨对虾血清ALP活性显著下降，与上述研究结果一致。其原因可能是IP的增加使得机体有足够的磷酸基团供各种生化反应使用，机体对ALP催化产生的磷酸基团需求减小，所以ALP的活性会有所下降。而对日本真鲈的研究发现，随着饲料磷水平(0.31%～1.17%)的增加，血浆ALP活性显著升高[27]。黑鲷幼鱼则表现为随着饲料磷水平的增加，血浆ALP活性在饲料总磷为1.12%时最低，进一步磷水平的增加，血浆ALP活性呈升高趋势[29]。本试验结果与之不同，这可能与因为试验对象、饲料组成等不同有关。

凡纳滨对虾属于无脊椎动物，具有先天性免疫系统[45]。酚氧化酶原激活系统是一种酶联级系统，甲壳动物的酚氧化酶原激活系统存在于血淋巴中的颗粒细胞，系统中的酚氧化酶可以被细菌脂多糖(LPS)、Ca2+及胰蛋白酶等激活后转变成具有活性的PO[46]。樊廷俊等[47]在对中国对虾酚氧化酶试验中，发现镁离子(Mg2+)、Ca2+能增强酚氧化酶的活性。本试验饲料中添加钙提高了凡纳滨对虾的血清PO活性，与上述研究一致；而随着饲料磷添加水平的提高，凡纳滨对虾血清PO活性呈先升高后降低的趋势。这可能是饲料中的磷主要以磷酸根的形式存在，过多的磷酸根与铁、镁等金属离子反应生成不溶性磷酸盐，从而影响铁、镁等离子的消化吸收，进而影响离子体内代谢[48]；Mg2+可提高PO活性，饲料中过高的磷水平可能是通过影响Mg2+的吸收进而影响血清PO的活性。

军曹鱼的试验中发现，血浆CHOL和TG含量随饲料磷添加水平升高而降低[19]。随饲料磷水平的升高，大黄鱼血清中CHOL和TG含量逐渐降低，具有明显的线性关系[49]。本试验饲料中添加磷降低了对虾血清CHOL和TG的含量。在黑鲷[22]、日本真鲈[27]、胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)[50]和双棘黄姑鱼(Protonibeadiacanthus)[51]上也有类似报道。黄晓聪[51]认为这与脂肪代谢有关，磷缺乏导致脂肪生成增多，当磷足够时脂肪生成减少，血液CHOL和TG的含量下降，本试验结果与上述试验结果类似。

本试验中，凡纳滨对虾血清IP含量随饲料磷添加水平的升高呈先升高后趋于稳定的趋势。这与在军曹鱼[52]、黑线鳕鱼[21]、马拉巴石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)[53]、日本真鲈[27]上的研究结果一致。

营养素间一定存在直接或间接的关系，彼此间或协同或拮抗或制约。因此，考虑营养素关系及养殖环境因子的双因素或多因素试验设计，其结果应更符合养殖的实际情况，对实际生产更有指导意义。但双因素或多因素试验，试验量巨大，获得准确的数据相对困难，因此多因素试验结果是否可作为凡纳滨对虾营养参数数据库的基础数据有待于进一步研究。