金刺梨黄色素提取条件及稳定性研究

谢国芳 田永林 邓玉莲 周笑犁 刘永玲 赵治兵 马立志

(1. 贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005；2. 贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州 贵阳 550005)

金刺梨(RosasterilisD.shi)又称无籽刺梨，蔷薇科蔷薇属多年生灌木，为贵州省特有种系，金刺梨果实含有蛋白质、糖、维生素、氨基酸、总酚、微量元素和SOD等功效成分[1-3]，鲜果香气成分丰富、香味浓郁[4-6]。近年来，随着金刺梨产业的快速发展，由于大量金刺梨鲜果集中上市，导致价格急剧下降，加之鲜果采后易纤维化、失水等引起食用品质和商品价值下降，严重制约该产业发展。目前，虽已开发了果酒、果醋、饮料、果酱、酸奶含片等金刺梨产品[7-10]，但均以金刺梨果汁为原料，由此产生大量的果渣。由于缺乏精深加工技术，果渣直接废弃，不仅浪费果渣中有效成分，还造成环境污染。

本试验拟对金刺梨黄色素提取条件进行优化，研究光照、pH、氧化剂、还原剂、金属离子、糖类对其稳定性及抗氧化能力的影响，明确金刺梨黄色素的提取条件及其适宜的食品体系，实现金刺梨黄色素开发利用，为延长金刺梨产业链提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

金刺梨鲜果：采摘于贵州省安顺市普定县金刺梨种植基地，采后立即运回实验室；

乙醇、丙酮、甲醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水溶性维生素E(Trolox)：分析纯，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：YH-A 6002型，瑞安市英衡电器有限公司；

超高速冷冻离心机：TGL-166RS型，上海安亭科学仪器厂；

超声清洗器：KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

紫外分光光度计：UV-2550型，日本岛津公司。

1.3 金刺梨黄色素提取条件

1.3.1 提取剂筛选 取适量金刺梨果实，按1∶20 (g/mL)料液比分别加入水、70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮，60 ℃下超声辅助提取1 h(200 W)，提取2次，合并滤液，测定其吸光值。

1.3.2 波长测定 取1.3.1中水为提取剂所得的提取液，以蒸馏水为空白，在200～700 nm波长范围内进行吸收光谱扫描，通过光谱扫描确定其最佳吸收波长为280 nm，与紫藤花萼中黄色素吸收波长一致[11]。

1.3.3 提取条件优化 对金刺梨黄色素提取条件提取剂浓度、提取温度、料液比和提取时间等进行试验设计，以吸光值为考核指标，得出金刺梨黄色素的最佳提取条件。各因素的水平范围见表1[12]。

表1 均匀设计因素水平表Table 1 Factors and levels of uniform design

1.4 金刺梨黄色素稳定性研究

按1.3所得最佳提取工艺提取金刺梨黄色素，稀释使其吸光值为0.2～0.4后，研究光照、pH、温度、氧化剂、还原剂、金属离子和糖类等对金刺梨黄色素稳定性的影响。

1.4.1 光照对金刺梨黄色素稳定性的影响 取100 mL提取液9份，分别于室外阳光直照、室内自然光和避光下放置，每处理3个平行，从早上9:00至下午18:00，每隔1 h测定其吸光值和体外抗氧化能力。

1.4.2 pH对金刺梨黄色素稳定性的影响 取45 mL提取液10份，用HCl和NaOH溶液调节提取液pH分别为3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，每处理3个平行，避光放置3 h后测定其吸光值和体外抗氧化能力。

1.4.3 氧化剂对金刺梨黄色素稳定性的影响 以H2O2为氧化剂，取10 mL提取液18份，以蒸馏水为对照，分别加入相同体积、不同浓度的H2O2溶液，使体系最终浓度分别为0.4‰，0.8‰，1.2‰，1.6‰，2.0‰，每处理3个平行，混匀后避光放置2 h后测定其吸光值和体外抗氧化能力。

1.4.4 还原剂对金刺梨黄色素稳定性的影响 以Na2SO3为还原剂，取10 mL提取液18份，以蒸馏水为对照，分别加入相同体积、不同浓度的Na2SO3溶液，使体系最终浓度分别为0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，每处理3个平行，混匀后避光放置2 h后测定其吸光值和体外抗氧化能力。

1.4.5 金属离子对金刺梨黄色素稳定性的影响 取8 mL提取液24份，以蒸馏水作为对照，分别加入8 mL 0.8 g/L的Zn2+、Cu2+、K+、Mg2+、Na+、Fe3+、Al3+溶液，每处理3个平行，混匀后避光放置2 h后测定其吸光值和体外抗氧化能力。

1.4.6 食品添加剂对金刺梨黄色素稳定性的影响 取15 mL 提取液15份，以蒸馏水作为对照，分别加入15 mL的10%葡萄糖、10%蔗糖、10%麦芽糖和2%乳酸，每处理3个平行，混匀后避光放置2 h后测定其吸光值和体外抗氧化能力。

1.5 抗氧化能力测定

1.5.1 Fe2+还原/抗氧化能力(FRAP) 参照Todorovic等[13]的方法。

1.5.2 DPPH自由基清除能力(DPPH) 参照Tauchen等[14]的方法。

1.5.3 总还原力(TRPA) 参照Oliveira等[15]的方法。

1.6 数据处理

采用Uniform Design Version 3.0软件进行均匀试验设计和分析，试验结果采用Microsoft Excel软件进行整理，并以平均值±标准偏差方式表示，采用Graphpad Prism 7.00软件作图。

2 结果与讨论

2.1 金刺梨黄色素提取条件

2.1.1 提取剂选择 由图1可知，与水相比，有机溶剂可显著提高粗提液的吸光值(P<0.05)，其中，70%丙酮作为提取液的吸光值显著高于70%乙醇和70%甲醇(P<0.05)，因此选用丙酮作为金刺梨黄色素提取剂。

不同字母表示不同提取剂间差异显著(P<0.05)图1 提取剂对黄色素吸光值的影响Figure 1 Effects of different extracted solvents on absorption of yellow pigment

2.1.2 金刺梨黄色素提取条件优化 均匀设计试验方案及结果见表2。

表2 均匀设计方案及结果Table 2 Uniform design and result

由表2可知，在试验11条件下提取液的吸光值最高。采用均匀试验设计软件进行逐步回归分析，其回归方差分析结果见表3，所得的吸光值随各因素变化的四元二次回归方程：

Y=-2.69-0.137A+0.317B-0.484C-0.392D+0.000 859A2-0.000 273B2+0.001 65C2+0.005 51D2。

(1)

回归方程的方差分析结果见表3。由表3可得，回归方程模型显著(P<0.05)，回归方程的决定系数R2=0.876 6，即方程可以解释87.66%的综合值数据变异，方程的拟合性好。因此可以用该回归方程对试验结果进行分析预测。

表3 回归方程的方差分析表Table 3 Variance analysisTable of regression equation

根据回归分析结果，以吸光值为依据，得到最优金刺梨黄色素的提取条件为：提取剂浓度79.74%、提取温度58.06 ℃、料液比1∶16.3 (g/mL)、提取时间3.56 h。从实际操作考虑，取提取剂浓度80%、提取温度58 ℃、料液比1∶16 (g/mL)、提取时间3.5 h，做4次验证实验得到提取液的吸光值为0.689。因此，在采用均匀设计与吸光值得到的金刺梨黄色素提取条件较为准确可靠，具有实用价值。

2.2 金刺梨黄色素稳定性研究

2.2.1 光照对金刺梨黄色素稳定性的影响 由图2可知，金刺梨黄色素贮藏期间吸光度呈现先降后升的趋势。前2 h不同光照间差异不显著(P>0.05)，3～6 h时太阳光直照金刺梨黄色素吸光值下降显著快于避光和室内自然光照(P<0.05)，随后(6～8 h)不同光照下金刺梨黄色素均显著上升(P<0.05)，说明太阳光促进金刺梨黄色素降解，与紫藤花萼黄色素的光敏性基本一致[11]，6 h后黄色素的吸光值增加主要是室温降低引起金刺梨黄色素可逆性变化引起的；在室内自然光和太阳光直照下黄色素的FRAP变化趋势一致；在太阳光直照下黄色素的DPPH呈现先增后降的趋势，在5 h时达到最大值，随后下降；在室内自然光下黄色素的DPPH则在前3 h内略微下降随后上升，在5 h时达到最大值；避光下黄色素的FRAP和DPPH显著低于室内自然光和太阳光直照(P<0.05)，可能是光照吸收紫外光增加黄色素的能量，从而促进Fe2+的氧化反应和DPPH清除能力。

不同字母表示不同光照下差异显著(P<0.05)图2 光照对黄色素吸光值和体外抗氧化能力的影响Figure 2 Effect of light on absorption and antioxidant capacity of yellow pigment

2.2.2 pH对金刺梨黄色素稳定性的影响 由图3可知，金刺梨黄色素吸光值随pH增加呈现持续上升趋势，说明pH增加对金刺梨黄色素具有增色作用，与密蒙花黄色素的变化规律一致[16]。pH 3～9时黄色素的FRAP相对稳定，TRPA则呈现上升趋势，当pH超过9之后黄色素的FRAP和TRPA急剧下降，由于FRAP和TRPA测定是在特定pH体系下，随着pH的增加破坏了特定条件下的pH体系，从而影响测定结果；pH 3～7时黄色素的DPPH呈现略微上升趋势，随后开始下降，pH为10时降到最低。虽然高pH有利于金刺梨黄色素呈色，但破坏了黄色素的抗氧化能力。因此，pH在5～7时金刺梨黄色素的抗氧化能力相对较高。

不同字母表示不同pH处理间差异显著(P<0.05)图3 pH对金刺梨黄色素吸光值和体外抗氧化能力的影响Figure 3 Effect of pH on absorption and antioxidant capacity of yellow pigment

2.2.3 氧化剂对金刺梨黄色素稳定性的影响 由图4可知，金刺梨黄色素吸光值、FRAP和DPPH随着氧化剂浓度增加呈现先降后增的趋势，在H2O2达到0.16%时吸光值最低，随后略有上升；TRPA则随氧化剂浓度增加呈现持续下降的趋势，当食品体系中H2O2达到0.12%时，TRPA完全丧失，说明金刺梨黄色素抗氧化能力偏弱，适合于添加在低浓度氧化剂食品体系中。

2.2.4 还原剂对金刺梨黄色素稳定性的影响 由图5可知，金刺梨黄色素的吸光值、FRAP和TRPA随还原剂浓度增加呈现持续上升趋势，在0.4% Na2SO3增加最快，然而DPPH则随还原剂浓度增加呈现持续下降趋势，说明还原剂对金刺梨黄色素具有增色效果，且提高了对Fe2+的氧化能力，但破坏了对DPPH自由基的清除能力。因此，金刺梨黄色素适合添加在含有低浓度还原剂食品体系中。

2.2.5 金属离子对金刺梨黄色素稳定性的影响 由表4可知，金属离子对金刺梨黄色素的影响存在较大差异，与紫藤花黄色素的影响一致[11]。Zn2+、Cu2+、K+、Mg2+、Na+和Al3+对金刺梨黄色素的吸光值影响差异不显著(P>0.05)，Fe3+显著增加黄色素的吸光值(P<0.05)，具有较好的增色效果；K+、Na+、Al3+、Cu2+和Zn2+对金刺梨黄色素的FRAP的影响差异不显著(P>0.05)，Mg2+显著升高金刺梨黄色素的FRAP(P<0.05)，Fe3+显著降低了金刺梨黄色素的FRAP(P<0.05)；所试金属离子均显著降低了金刺梨黄色素的DPPH(P<0.05)，说明金属离子破坏其对DPPH清除能力；Mg2+和Al3+显著增加金刺梨黄色素的TRPA(P<0.05)，说明Mg2+和Al3+具有增加其TRPA的效果；K+、Na+、Cu2+、Fe3+和Zn2+显著降低了金刺梨黄色素的TRPA(P<0.05)，说明对TRPA有破坏作用。

不同字母表示不同浓度H2O2间差异显著(P<0.05)图4 氧化剂对金刺梨黄色素吸光值和体外抗 氧化能力的影响Figure 4 Effect of oxidant on absorption and antioxidant capacity of yellow pigment

2.2.6 糖类对金刺梨黄色素稳定性的影响 由图6可知，添加葡萄糖组1 h时黄色素的吸光值显著低于对照和其他糖类(P<0.05)，添加糖类3 h时金刺梨黄色素的吸光值均低于对照组，然而添加蔗糖组6 h时金刺梨黄色素的吸光值高于对照组和其他糖类，与对照组差异不显著(P>0.05)，与糖类对密蒙花黄色素的影响[17]一致；添加葡萄糖和蔗糖对金刺梨黄色素的FRAP差异不显著(P>0.05)，添加麦芽糖可显著增加黄色素的FRAP(P<0.05)；添加糖类组1，3 h时DPPH显著低于对照组(P<0.05)；添加糖类1 h时显著增加黄色素的TRPA(P<0.05)，添加糖类3 h时对黄色素TRPA影响较小，添加糖类6 h时黄色素的TRPA反而显著降低了(P<0.05)。

表4 金属离子对金刺梨黄色素吸光值和体外抗氧化能力的影响†Table 4 Effect of metal ions on absorption and antioxidant capacity of yellow pigment

† 同列不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)图6 糖类对黄色素吸光值和体外抗氧化能力的影响Figure 6 Effect of sugar on absorption and antioxidant capacity of yellow pigment

3 结论

金刺梨黄色素具有较好的水溶性、稳定性和安全性，是安全的食品添加剂，利用生产金刺梨果汁产生的残渣提取黄色素，不仅能提高资源利用率和附加值，还能增加具有较好的开发潜力。研究中发现不同贮藏环境和食品体系不仅影响黄色素的稳定性，也对其抗氧化能力产生较大影响，说明在关注色素稳定性的同时，应注重其功效活性，最大限度降低对色素的影响，而且金刺梨黄色素的组分、化学结构尚不清楚，仍需进一步深入研究。