鸭血清中H5亚型禽流感抗体检测方法的研究1

范红英

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

禽流感（Avian Influenza，AI），是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一种禽类急性传染病［1］.禽流感病毒是一种甲型流感病毒，根据其对禽类发病情况不同，分为高致病性、中致病性、低致病性三个级别.目前发现可以直接感染人的禽流感病毒亚型以H5、H7两种亚型比较普遍，由这两种亚型引起的疫情严重危害了家禽养殖业.水禽是AIV的天然宿主，也是禽流感病毒的天然贮藏库，几乎所有亚型的禽流感病毒都可以在水禽中分离到［2］.世界卫生组织将高致病性禽流感列为A类动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病［3］.血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI）作为检测部门常用的检测方法，是检测血清抗体水平的技术之一［4-5］，但在实际应用中容易受到一些因素的干扰，包括试验的环境温度、抗原-抗体的作用时间、稀释液PBS的pH等等外界的影响因素［6-9］等.研究发现，试验环境温度较高应用血凝抑制试验检测出禽流感的抗体效价相对较高，稀释液PBS的pH过高或者过低都会对试验检测抗体效价造成影响.抗体的效价随着抗原-抗体的作用时间的增加而增高［10］.除此之外，血清中的非特异性凝集因子也对水禽类病毒检测影响较大，造成的错判率达30%以上［8，11-12］.通过红细胞吸附法［13］、鸭血球直接测定法、生物化学试剂去除法［14］进行血凝抑制试验，均有明显去除非特异性凝集因子的效果.

我国地域宽广，水系丰富，尤其是珠三角地区水禽养殖业最为发达，采用血凝试验和血凝抑制试验快速、准确、简便的检测抗体水平，对禽流感的预防监测工作非常重要.研究通过对影响鸭血清中H5亚型禽流感病毒血凝与血凝抑制试验的因素分析，目的是在检测鸭血清禽流感病毒抗体时，能够降低非特异凝集现象，提高检测结果的准确性，因此对鸭禽流感病毒抗体水平的监测工作具有非常重要的现实意义.

1　材料与方法

1.1　实验材料

16份禽流感H5亚型阳性鸭血清（已经注射过H5亚型禽流感疫苗），均采自惠州市某鸭养殖场.

1.2　鸭血清处理

1.2.1鸭血清的抽取

采用翅下静脉采血，从鸭场中选取16个样本，每样本抽取5 mL新鲜鸭血，1000 r/min离心4 min后，抽取上清液于16个Eppendorf管中.

1.2.2鸭血清的分装和保存

将抽取的每份鸭血清样本平均分装在3个Eppendorf管中，并且保存于4℃，待检.

1.2.3用鸡红细胞泥吸附法处理鸭血清

从冰箱中取出16份不同的鸭血清，一段时间后，让鸭血清完全解冻.按照红细胞泥和血清1：20的比例，加入红细胞泥后，静置30 min，1200 r/min离心10 min，抽取出上清液于Eppendorf管中，待检.

1.2.4鸭血清灭活处理

从冰箱中取出16份不同的鸭血清，一段时间后，让鸭血清完全解冻.将血清置于56℃的水浴锅中，水浴30 min，冷却至室温，待检.

1.3　血凝与血凝抑制试验

1.3.1测定抗原效价

按照技术规范GDFB249-2004微量血液凝集试验（HA）方法进行测定.

1.3.2抗原工作浓度的配制

用PBS配制4个血凝单位的抗原浓度作为工作浓度（4个血凝单位抗原浓度=抗原效价×4）.

1.3.3回归试验（校正实验）

抗原换为配制好的4个血凝单位抗原，按照技术规范GDFB249-2004微量血液凝集试验（HA）方法进行.若第1、2、3孔的红细胞完全凝集，第4孔的红细胞开始出现沉淀，第五孔红细胞的完全沉淀，如果出现以上结果，则表明所配4个血凝单位的抗原浓度准确.

1.3.4抗体效价测定

依照技术规范GDFB249-2004进行血凝抑制试验.血凝抑制试验分3个试验组：第1组待检血清为未经处理的鸭血清；第2组待检血清为用鸡红细胞泥吸附方法处理的血清；第3组待检血清为灭活的血清.

出现完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度倍数M，用log2M值来表示为被检血清中的抗体效价.判定结果时将微量板做45°竖立，当反应板中孔底部的红细胞无法流泪似地流下时，立即判定被检血清抗体效价.记录经过灭活、用红细胞吸附处理和未经处理在不同试验环境温度下被检血清的抗体效价和祛除非特异性凝集因子的情况，并列表比较.

1.5　数据处理

使用SPSS Statistics v20.0软件对数据进行相关分析、方差分析和样品配对t检验.相关性判断标准：R＞0表示正相关，R＜0表示负相关；差异显著性判断标准为：P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著.

2　结果与分析

2.1　鸭血清中非特异性凝集因子祛除效果

由表1可知，用红细胞泥处理鸭血请后的检测试验中，非特异性凝集现象明显减少，高浓度和低浓度血清试验中均没有发现非特异性凝集现象，说明此法对鸭血清中非特异性凝集因子的祛除效果非常好.然而在血清不做任何处理和血清灭活处理两个条件下，每个高浓度血清样品在3个试验温度都出现了非特异性凝集现象.以血清不做任何处理条件下的非特异性凝集更加明显，每个样品平均有1.5个以上的孔出现了非特异性凝集现象.

在低浓度血清灭活后的检测中，3个试验温度下都没有出现非特异性凝集现象.相对于对照组，血清灭活再进行血凝抑制试验检测H5亚型禽流感病毒抗体时，非特异性凝集现象减少，低浓度血清下几乎没有非特异性凝集.虽然高浓度血清下，非特异性凝集依然存在，但对检测结果的判定不造成影响.由此可以说明血清用红细胞泥处理和灭活处理后进行血凝抑制试验检测H5亚型禽流感病毒抗体时，检测结果的判定不会受到非特异性凝集现象的干扰.但是，这两种处理方法是否会影响结果准确性，需要对结果进一步进行生物统计学分析.

表1　不同处理下非特异性凝集的祛除效果

2.2　血凝抑制试验检测结果的生物统计学分析

对血凝抑制试验检测出的抗体效价采用生物统计学分析.对16个样品在3个不同试验温度下的检测结果采用SPSS进行相关分析，见表2.结果显示，不同的血清处理方法，检测出的抗体效价和试验温度的相关系数都为正数，说明试验温度和检测出的抗体效价呈正相关关系，即试验温度越高，检测出的抗体效价越高.可见，试验温度会对检测结果造成影响.这种影响显不显著，则需要再进一步进行分析.

表2　3个不同试验温度下检测结果的相关性分析

由于禽类体内的抗体水平是固定的，不同条件下的检测可能会有不同的误差，对所检测的抗体效价影响越不显著，说明检测出来的结果越准确.采用SPSS对检测出的鸭血清中H5禽流感病毒抗体效价进行方差分析，结果如表3所示.可以看出，试验环境温度对所检测抗体效价的影响极显著（P＜0.01），说明试验环境温度的改变会严重影响抗体的效价.表3中还显示，试验环境温度与血清处理的方法之间的互相作用对所检测的抗体效价的影响达到了极显著的水平（P＜0.01），说明试验环境温度的改变和血清处理方法的共同作用对检测出的抗体效价影响也很大.然而，血清的处理方法对抗体效价的影响则不太显著（P≈0.05），说明血清的处理方法对检测结果存在影响，但不是十分明显.因此，在实际的检测中，应该注意用血清的处理方法来选择控制合适的试验环境温度.

表3　鸭血清中H5禽流感病毒抗体效价的方差分析

目前，由农业部行业标准NY/T7692004可知，血凝试验的环境为25℃，即为室温条件下，检测出的抗原效价的准确性较高，禽流感抗体水平的评判标准也是在试验环境温度为25℃的条件下制定的.所以，技术规范GDFB249-2004中的规定，检测禽流感抗体效价在室温下，血清不做任何处理进行检测.本研究采取了不同试验环境温度和对血清不同处理方法进行血凝抑制试验对鸭血清H5亚型禽流感病毒抗体进行检测，改变了规定的条件，则需要对其检测结果的准确性进行判断.因此，采用SPSS对检测结果分别与试验温度为25℃血清不做任何处理进行配对样本t检验对比，见表4.

由表4可见，血清灭活处理在3种试验环境温度下，与25℃下血清不做任何处理的检测结果差异性不显著（P＞0.05），说明血清灭活处理在3种试验环境温度下对血凝抑制试验所检测出来的抗体效价的准确性影响很小，这些条件在进行鸭血清的血凝抑制试验中均可采用.因此，可以对血清灭活后再进行血凝抑制试验检测H5亚型禽流感病毒抗体水平.

然而，4℃下血清用红细胞泥处理与25℃下血清不做任何处理的结果差异显著（P＜0.05），25℃、37℃下血清用红细胞泥处理与25℃下血清不作任何处理的结果为极显著水平（P=0.01）.由此可见，用红细胞泥吸附血清后检测出的抗体效价和25℃下血清不做任何处理检测出的抗体效价的差异性很大，这种处理方法会对检测结果的准确性造成影响.因此，在实际进行检测时，为了确保检测结果的准确性，不建议采用红细胞泥吸附血清处理后再进行检测.

表4　血清灭活处理和红细胞泥吸附处理与对照结果的t检验

3　结论与讨论

鸭血清中H5亚型禽流感病毒抗体检测进行的血凝试验是依据在试验中鸡的红细胞发生凝集作用，但是会被鸭血清中抗体所抑制而沉淀下去，通过抑制的情况大小来判定被检血清中抗体的效价［15-16］.然而，水禽的血清中通常含有一种或者多种非特异性凝集因子，当被检的水禽动物血清中非特异性凝集因子存在时，将会影响鸡红细胞在血凝抑制中凝集，直接影响动物检验检疫的准确性和权威性，给国内外动物贸易和疫病的预防带来不良影响［17-18］.

本研究采用了3种不同的试验温度和2种不同的血清处理方法，结果发现，2种血清不同的处理中，血清灭活处理后，鸭血清中的非特异性凝集因子有所减少，在低浓度血清下进行检测，几乎没有发现非特异性凝集现象.虽然在高浓度血清下，非特异性凝集依然存在，但是这对结果的判定不会造成影响.说明灭活血清后，可以减少一些非特性因子，降低在检测工作中的误判.用红细胞泥吸附处理后，对鸭血清中的特异性凝集因子祛除效果非常好，高浓度的血清下进行检测，也没有发现有非特异性凝集反应.但是，用红细胞泥吸附后再进行检测，3个不同试验温度下的检测结果与25℃下血清不做任何处理的结果都有显著性差异，甚至极显著差异.因此，在确保检测结果的前提下，对于红细胞泥处理鸭血清这种方法是否能够真正在检测中推广，仍需进一步深入研究完善.

本次研究还发现，在高的试验温度和低的试验温度下，非特异性凝集因子引起的凝集反应较少，可以减少检测中非特异凝集引起的误判.但是，试验环境温度对抗体效价的影响极显著（P＜0.01），环境温度对检测的结果影响比较大.根据相关研究发现，血凝抑制试验检测出的抗体效价跟试验环境温度有关，试验环境温度越高，所测出的效价越高［11］.而且，当温度过低，出结果慢，温度过高，出结果过快［5］.影响结果的判断，从而影响准确性.并且，在实际检测中，25℃就是室温温度，操作上比较方便控制，在一些基础条件比较落后的兽医站和没有恒温箱下都可以进行检测.因此，试验环境温度为25℃是比较合适的温度.

虽然用红细胞泥吸附后对非特异性凝集因子的祛除效果最好，但是检测出抗体效价不准确.而血清灭活处理后对抗体的效价不会造成影响，与25℃下血清不做任何处理检测出的结果差异不大.所以，试验环境温度为25℃下且血清灭活后，可以作为进行鸭血清血凝抑制试验的合适条件，该条件下检测出的抗体效价跟不做处理检测出的结果相比较，两者差异性不显著（P＞0.05），检测出来的结果具有可靠性.

因此，在实际检测中，可以先对血清进行灭活处理后，再在25℃的环境温度下进行抗体水平的检测，能够正确的对禽流感病毒抗体水平进行准确地监控，且血清的灭活操作简单、时间短，对于条件较差的兽医站也可以实现.因此，这种方法对监测鸭血清H5亚型禽流感病毒抗体水平具有重要的现实意义和实用价值，可为检测部门提供参考，对其他水禽的H5亚型禽流感病毒抗体水平检测也具有重要意义［19］.