VEGF、VEGFR2在慢性砷中毒大鼠生精小管中的表达及其意义*

戴研平，王平，高晓勤

（1.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550004；2.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563006）

砷是一种广泛存在于自然界的类金属元素和人类致癌物[1]。研究表明，慢性砷暴露可影响人类的生殖和发育，但目前关于砷致癌及生殖毒性的具体机制尚不明确[2-4]。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体2（vascular endothelial growth factor recepector 2,VEGFR2）与精子的发生和成熟有关。目前尚未见砷中毒及VEGF、VEGFR2与男性不育相关性的报道。本实验通过研究VEGF、VEGFR2在慢性砷中毒大鼠睾丸中的表达变化，检测生精上皮细胞凋亡情况，探讨慢性砷中毒对大鼠睾丸损伤的机制，为慢性砷中毒不育的防治提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　实验动物

选择体重160～200 g健康清洁级雄性SD大鼠40只，由贵州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCK（黔）2002～0001。动物饲养环境温度23～25℃，相对湿度60%～65%。实验期间，大鼠可自由摄食、饮水。

适应性饲养1周后，将大鼠随机分为4组：对照组（蒸馏水），以及低（2.4 mg/L）、中（12.0 mg/L）、高（60.0 mg/L）剂量染毒组，每组10只。采用自由饮水方式连续染毒6个月。每天测定并记录大鼠体重，观察大鼠外观行为变化。

1.2　主要试剂

VEGF、VEGFR2兔抗鼠多克隆抗体（英国Abcam公司），细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程公司），亚砷酸钠（分析纯，北京化工厂）。

1.3　方法

1.3.1免疫组织化学法睾丸石蜡切片，用二甲苯化蜡至水，0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）微波修复15 min，冷却至室温，30 ml/L过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min，10 ml/L Triton-100浸泡30 min增加细胞通透性，山羊血清37℃封闭30 min后加一抗（1∶50），4℃孵育过夜，恢复室温40 min后滴加山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h，DAB显色5 min，苏木精复染2 min，常规脱水、透明、封片。以上步骤间均用0.01 mmol/L PBS（pH 7.0～7.4）洗3次，5 min/次。采用Olympus BX51显微镜拍照，IPP 6.0图像分析软件计算阳性细胞平均灰度值。

1.3.2末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）取大鼠左侧睾丸石蜡组织切片，按照细胞凋亡试剂盒说明书采用末端脱氧核苷酸介导的dUTP原位TUNEL检测睾丸生精小管细胞凋亡情况。细胞核中出现棕黄色颗粒为凋亡细胞。每组随机取3张连续切片，每张观察5个视野，采用Mias图像分析软件测定凋亡细胞核的平均灰度值。

1.3.3精子形态观察采用加样枪每组吸取40μl精子悬液滴在载玻片上，用玻片将悬液轻轻推开，让其自然晾干，甲醇固定10 min，晾干，1%伊红染色10 min，流水冲洗、晾干。采用盲法在光学显微镜下观察精子形态。

1.3.4精子活力测定取一侧附睾，用37℃生理盐水冲洗，眼科剪剪碎，37℃生理盐水5 ml，吸管抽吸5次，37℃恒温箱10 min，待精子充分游离后，采用伟力精子分析系统记录精子浓度、精子活动率及各个活动精子浓度。

1.4　统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　VEGF、VEGFR2在睾丸中的表达

2.1.1VEGF免疫组织化学法结果显示，VEGF阳性产物主要位于睾丸精原细胞和支持细胞的胞质及胞核、初级精母细胞及精子细胞的顶体、精子残余体。各染毒组与对照组的VEGF灰度值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组较染毒组下降。见表1和图1。2.1.2VEGFR2VEGFR2阳性产物主要位于睾丸精子细胞的顶体及精子头部、精原细胞及支持细胞的胞质及胞核。各染毒组与对照组的VEGFR2灰度值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组较染毒组下降。见表1和图2。

表1　各组大鼠睾丸VEGF、VEGFR2灰度值比较（n=10，±s）

表1　各组大鼠睾丸VEGF、VEGFR2灰度值比较（n=10，±s）

注：†与对照组比较，P＜0.05

对照组　109.60±0.41　90.12±0.37低剂量染毒组　127.80±0.62†　117.60±0.71†中剂量染毒组　136.70±0.95†　130.20±0.50†高剂量染毒组　145.00±0.60†　151.20±0.32†F值　36.941　5.981

2.2　睾丸生精小管的细胞凋亡情况

TUNEL染色结果显示，凋亡细胞呈棕黄色，对照组睾丸生精小管偶见凋亡细胞，各染毒组上皮凋亡细胞核染色深，核固缩，体积比正常细胞小，染色质浓缩聚集于核膜下。对照组，以及低、中、高剂量染毒组大鼠睾丸生精小管上皮细胞核灰度值分别为（92.42±0.36）、（133.0±0.72）、（150.32±0.23）和（164.20±0.85），经方差分析，差异有统计学意义（F=56.692，P=0.000），各染毒组凋亡细胞数较对照组增多。见图3。

2.3　精子形态

对照组精子形态正常，低剂量染毒组精子形态基本正常，偶见异常精子结构不完整和尾部折叠；中剂量染毒组异常精子明显增多，可见精子头部与尾部分离畸形；高剂量染毒组正常数量明显减少，畸形精子比例明显升高，可见精子头尾分离和尾部折叠现象。见图4。

2.4　精子活力

各组大鼠精子浓度、精子活动率、活动精子浓度比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，各染毒组大鼠精子活动率、活动精子浓度较对照组低（P＜0.05）。与对照组比较，低剂量染毒组大鼠精子浓度较高，而中、高剂量染毒组大鼠精子浓度较低（P＜0.05）。见表2。

图1　VEGF在大鼠睾丸生精小管中的表达（免疫组织化学法×400）

图2　VEGFR2在大鼠睾丸生精小管中的表达（免疫组织化学法×400）

图3　大鼠睾丸生精小管细胞核凋亡情况（TUNEL染色×400）

图4　各组大鼠附睾精子涂片（伊红染色×100）

表2　各组大鼠精子活力比较（n=10，±s）

表2　各组大鼠精子活力比较（n=10，±s）

注：†与对照组比较，P＜0.05

活动精子浓度/%对照组　46.51±17.20　54.72±9.70　26.30±12.20低剂量染毒组　65.70±21.20†　43.20±12.80†　23.05±11.04†中剂量染毒组　23.20±5.10†　40.43±10.80†　12.05±5.01†高剂量染毒组　19.80±9.08†　37.53±9.86†　10.02±4.80†F值　6.486　5.031　8.872P值　0.016　0.018　0.003组别　精子浓度/（×106个/ml）精子活动率/%

3　讨论

砷是一种广泛存在于自然环境中的化学污染物和A类致癌物。VEGF及其受体是体内与生殖相关的重要生长因子之一。VEGF能够促进血管生成，在已发现的3种VEGF受体中，VEGFR2即KDR是血管发生和构建的主要调节者。VEGFA与VEGFR2结合后能介导VEGF促进内皮细胞增殖、促内皮细胞存活作用与抗凋亡、促进内皮细胞迁移、提高血管通透性[5-7]。

研究证明，VEGF与男性生殖及细胞凋亡有关。VEGF在睾丸中发挥重要作用，与生精功能的调节有关[8]。VEGF在附睾中起重要作用，参与附睾血管功能调节和微环境的形成[9]。VEGF与精索静脉曲张有关[10]。VEGF与精囊、前列腺疾病有关[11]。睾丸生精功能受神经—内分泌调节，多种生长因子和性激素在生精细胞的分裂、增殖、分化等过程中发挥重要作用[12-13]。睾酮可正向调节VEGF的表达，对男性生育能力起关键作用[14]。本课题组前期研究发现，慢性砷中毒对大鼠睾丸中促黄体生成素（luteotropic hormone,LH）有影响，且随着亚砷酸钠暴露剂量的增加，大鼠血清LH浓度呈下降趋势[15]。砷中毒还导致雄性大鼠血清抑制素-B和睾酮分泌减少[16]。慢性砷中毒能导致精子受精能力降低[17]。本研究免疫组织化学法结果显示，与对照组相比，各染毒组VEGF、VEGFR2表达水平呈下降趋势，原因可能是随着砷中毒剂量的增加和时间的延长，影响睾丸性激素尤其是睾酮的分泌水平下降，进而引起VEGF、KDR蛋白表达下调。

细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡的过程。病理状态下可导致疾病肿瘤的发生。本研究中TUNEL法结果表明，与对照组比较，各染毒组大鼠睾丸生精小管上皮凋亡细胞灰度值较低，表明砷中毒可引起睾丸生精上皮细胞凋亡，且随着染毒剂量的增加，生精小管上皮细胞凋亡水平逐渐升高。

附睾是精子成熟的场所，精子活力能够反映雄性生殖毒性，也是决定生育能力的重要因素，而评价精子活力的指标主要有附睾内精子浓度、活动率和活动精子浓度。研究表明，生精细胞的活动可受外源性化学物质的影响，导致精子活力下降[18]。生精细胞的数量和成熟程度是精子生成的最初决定因素。本研究结果显示，与对照组比较，低剂量染毒组大鼠精子浓度较高，而中、高剂量染毒组精子浓度较低。各染毒组大鼠精子活动率、活动精子浓度较低，可能与睾丸支持细胞的功能改变有关。

综上所述，随着砷中毒染毒剂量的增加和时间的延长，VEGF、VEGFR2表达水平逐渐下降，而生精上皮的凋亡水平逐渐升高。慢性砷中毒时可影响VEGF、VEGFR2的表达和睾丸内微环境的形成，间接改变精子发生、发育，进而导致男性不育，但其具体机制有待进一步研究。