雷公藤内酯醇抑制TNF-α表达对小鼠溃疡性结肠炎的影响*

张海峰，张彬，周国雄，陈卫昌

（1.南通大学附属医院，江苏 南通 226001；2.苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006）

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）主要促炎因子。研究表明，TNF-α在UC血清、局部组织中的表达明显升高[1-7]。雷公藤内酯醇（Triptolide，TL）是从中药雷公藤中分离的二萜内酯化合物，具有抗炎、免疫调节作用[8-17]。本实验应用TL治疗UC小鼠，观察治疗前后小鼠的病情变化，以及TL与疾病的相关性，进一步明确TL是否对UC有疗效，以及是否与抑制TNF-α的表达有关。

1　材料与方法

1.1　材料

选择4～6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠80只，由南通大学动物实验中心提供，在南通大学动物实验中心动物房按常规方式喂养。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt,DSS）（美国 MP Biomedicals公司），TL（中国南京泽郎医药科技有限公司），Trizol抽提RNA试剂（美国Invitriogen公司），PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），TNF-α多克隆抗体（兔抗小鼠，美国Abcam公司），二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。本实验已通过南通大学附属医院医学伦理委员会审批。

1.2　方法

1.2.1动物模型的复制按STEVCEVA[18]和张艳丽等[19]的方法复制DSS实验动物模型，除空白对照组外，其他组小鼠饮用5% DSS溶液（5g DSS溶于100 ml蒸馏水）7 d。

1.2.2实验分组将80只雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、生理盐水组、丙二醇组、地塞米松组、美莎拉嗪组，以及TL 1、2、3组8组，分笼饲养，每笼10只。空白对照组：不予任何处理；生理盐水组：DSS模型复制成功后腹腔注射生理盐水0.2 ml/次，1次/d；丙二醇组：腹腔注射20%丙二醇0.2 ml/次，1次/d；地塞米松组：地塞米松0.1 mg/（kg·d）溶于生理盐水中腹腔注射；美沙拉嗪组：美沙拉嗪20～30 mg/kg溶于水中经胃管注入，3次/d；TL 1组：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射药量为0.20 mg/（kg·d）；TL 2组：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射药量为0.40 mg/（kg·d）；TL 3组：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射药量为 0.60 mg/（kg·d）。

1.2.3疾病活动指数（disease activity index,DAI）评分各组从第1天开始，每日观察、记录小鼠的一般情况，包括精神、活动、饮食、体重变化，同时观察小鼠的大便性状及便血情况，分析治疗前后结肠病变的变化。参照MURANO等[20]的标准进行DAI评分（见表1）。DAI=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。大便性状分数分为：①正常大便，可成型颗粒样大便；②松散便，不与肛门相黏的糊状粪便或半成形不黏肛便；③稀便，黏于肛门的水样便。大便隐血检测采用传统联苯胺法。

1.2.4大体形态学评分模型复制成功后第8天，采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，分离整段结肠组织并纵行剖开结肠，预冷生理盐水冲洗清洁数次，用滤纸滤干，大头针展开平铺，固定结肠组织。用肉眼观察结肠黏膜炎症及溃疡发生情况，参照EKSTROM等[21]的标准进行评分：黏膜无损害计0分，黏膜充血计1分，溃疡面积＜25%受损面积计2分，溃疡面积占25%～50%受损面积计3分，溃疡面积＞50%受损面积计4分。将病变明显肠段分为3部分：一部分用4%甲醛固定，送病理科，行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色；一部分于 -80℃条件下保存，留做逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）； 另一部分提取蛋白，留做Western blot检测。

表1　DAI评分标准

1.2.5结肠病理组织学观察及评分取病变组织常规石腊包埋、切片、HE染色，参照BOIRIVANT等[22]的标准行盲法评分，由2位病理科医师分别双盲阅片，结果取均值进行评分。组织学评分标准：正常计0分；极低白细胞浸润、＜10%高倍视野（high power field,HPF）计1分；少量白细胞浸润、10%～25% HPF计2分；中量白细胞浸润、25%～50% HPF，同时伴血管密集和肠壁增厚计3分；大量白细胞浸润、＞50% HPF、血管高度密集、隐窝变形、扭曲计4分。

1.2.6酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）收集血液，3 000 r/min离心 10 min，将血清与红细胞分离；3 000 r/min离心30 min取上清，3 000 r/min离心10 min去除颗粒和聚合物。操作步骤：在室温下平衡20 min后从铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度的标准品50μl/孔；样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl/孔，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50μl，15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD值。结果判断：绘制标准曲线，在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.2.7RT-PCR取适量病变组织提取总RNA，逆转录合成cDNA，行PCR扩增。TNF-α正向引物：5’-CCTCAGGAACGGGACTCGAA-3’，反向引物：5’-ATGTACACCAAGTCGGTAGCACCA-3’，扩增片段长度86 bp；内参照β-actin正向引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，反向引物：5’-CCACAGGATTCCATACCCAA-3’，扩增片段长度446 bp。PCR反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，58℃退火25 s，72℃延伸35 s，共循环45次，于每个循环的72℃时采集荧光数值。为检测每个反应的特异性，循环结束后分析熔解曲线，分析条件为95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s。为消除样本、逆转录和PCR反应的差异，以目的基因TNF-α 和β-actin mRNA含量的比值作为评价目的基因表达水平的指标。

1.2.8Western blot检测提取总蛋白，用紫外分光光度法测定总蛋白浓度，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白上样量20μl/孔。在垂直电泳槽中电泳后转膜至硝酸纤维素膜上，5% TBST封闭4 h，加入稀释的TNF-α一抗（工作浓度1∶2 500）4℃孵育过夜；TBST洗膜10 min/次，共5次，加入稀释的二抗（工作浓度1∶5 000）孵育2 h，用增强化学发光荧光试剂显影。以β-actin（47 kDa）为内参照，用凝胶成像分析系统处理数据，以TNF-α（17 kDa）与内参照的灰度比值作为蛋白的相对表达量。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，比较采用重复测量设计的方差分析或单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　实验动物观察

各组小鼠从开始处理后7 d内每天固定时间评估各组小鼠DAI评分，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间的DAI评分有差别（F=37.841，P=0.000）；②各组 DAI评分有差别（F=55.512，P=0.000）；③各组DAI评分变化趋势有差别（F=29.662，P=0.000）。空白对照组小鼠精神状态、活动、饮食等一般情况良好，大便性状正常，体重逐步增加。生理盐水组、丙二醇组小鼠模型复制成功后第1、2天开始饮食减少、活动能力下降，毛色无光泽、体重减少，同时排便次数逐渐增多，大便性状发生改变（软便、稀糊状、水样便等）；第3、4天大便隐血或出现暗红色、鲜红色血便。进一步两两比较经LSD-t检验，生理盐水组、丙二醇组小鼠DAI评分与空白对照组比较，差异有统计学意义（t=22.368和24.526，均P=0.000）。TL 2、3组，以及地塞米松组、美莎拉嗪组在复制模型的同时给予相应治疗后，各组小鼠精神状态好转，活力明显增加，饮食及体重较生理盐水组、丙二醇组下降幅度减少，毛色有改善，便血或大便隐血情况明显好转，部分大便形态逐渐恢复为软便或者固体便；TL 2、3组，以及地塞米松组、美莎拉嗪组小鼠DAI评分与生理盐水组比较，差异有统计学意义（t=9.226、8.880、7.582和8.006，均P=0.000）；TL 2、3组，以及地塞米松组、美莎拉嗪组小鼠DAI评分与丙二醇组比较，差异有统计学意义（t=11.228、10.663、10.002和 9.445， 均P=0.000）。结果显示，TL与地塞米松、美莎拉嗪有类似效应，能改善UC小鼠的一般情况。见表2。

表2　各组小鼠不同时间DAI评分比较（n=10，分，±s）

表2　各组小鼠不同时间DAI评分比较（n=10，分，±s）

组别　1 d　2 d　3 d　4 d　5 d　6 d　7 d空白对照组　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000生理盐水组　0.292±0.213　0.417±0.154　1.083±0.661　2.167±0.563　3.000±0.642　3.750±0.345　4.002±0.560丙二醇组　0.333±0.000　0.333±0.000　1.000±0.356　2.292±0.602　2.917±0.345　3.708±0.452　4.120±0.602地塞米松组　0.292±0.118　0.292±0.118　0.500±0.436　0.917±0.556　1.617±0.427　2.083±0.345　2.475±0.330美沙拉嗪组　0.292±0.118　0.302±0.120　0.625±0.336　1.017±0.502　1.717±0.489　2.223±0.405　2.575±0.410 TL 1 组　0.250±0.236　0.333±0.178　0.708±0.415　1.542±0.469　2.417±0.345　3.375±0.415　3.875±0.173 TL 2 组　0.250±0.154　0.333±0.178　0.416±0.345　1.325±0.575　1.708±0.603　2.308±0.547　2.917±0.345 TL 3 组　0.333±0.000　0.333±0.000　0.483±0.167　1.417±0.569　1.867±0.793　2.217±0.631　2.767±0.272

2.2　各组小鼠结肠大体形态学评分比较

空白对照组、生理盐水组、丙二醇组、地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 1、2、3组小鼠结肠大体形态学评分分别为（0.300±0.100）、（3.206±0.306）、（3.022±0.282）、（1.826±0.168）、（1.968±0.204）、（2.632±0.282）、（2.202±0.228）和（2.060±0.202）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=30.360，P=0.000）。空白对照组大部分小鼠结肠黏膜无充血、糜烂及溃疡，少部分结肠黏膜见少许散在充血。生理盐水组、丙二醇组小鼠直肠及近肛侧结肠黏膜弥漫性充血、水肿，伴多发性糜烂、浅表溃疡，部分溃疡表面有坏死组织；近口侧结肠充血水肿、散在糜烂，无明显溃疡形成。地塞米松、美莎拉嗪治疗组，以及TL 2、3组小鼠近肛侧结肠黏膜轻、中度充血，水肿，糜烂形成较生理盐水组、丙二醇组明显减少，部分散在浅溃疡；近口端结肠病变不明显。进一步两两比较经LSD-t检验，空白对照组与生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠大体形态学评分比较，差异有统计学意义（t=25.532和25.731，均P=0.000）；TL 2组与生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠大体形态学评分比较，差异有统计学意义（t=7.442和6.396，均P=0.000）；TL 3组与生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠大体形态学评分比较，差异有统计学意义（t=8.840和7.844，均P=0.000）。TL能减轻UC小鼠结肠炎症。见图1。

图1　各组小鼠结肠大体形态学评分比较（n=10，±s）

2.3　各组小鼠结肠病理组织评分比较

空白对照组、生理盐水组、丙二醇组、地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 1、2、3组小鼠结肠病理组织评分分别为（0.750±0.100）、（3.562±0.326）、（3.488±0.302）、（1.666±0.192）、（1.802±0.224）、（2.808±0.282）、（2.020±0.222）和（1.862±0.206）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=22.358，P=0.000）。HE染色结果显示，空白对照组小鼠结肠上皮结构、腺体结构完整无破坏，黏膜无糜烂及溃疡形成，部分黏膜下层可见少量中性粒细胞浸润；生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠黏膜上皮结构破损，见糜烂及溃疡形成，黏膜及黏膜下层可见大量的淋巴细胞和单核细胞、少量中性粒细胞浸润，固有层腺体变形、排列紊乱，部分破坏；地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 2、3组小鼠结肠黏膜可见數量不等淋巴细胞和单核细胞浸润，糜烂及溃疡程度较生理盐水组、丙二醇组减轻。进一步两两比较经LSD-t检验，空白对照组与生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠病理组织评分比较，差异有统计学意义（t=23.325和24.344，均P=0.000）；TL 2组与生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠病理组织评分比较，差异有统计学意义（t=11.058和11.078，均P=0.000）；TL 3组与生理盐水组、丙二醇组小鼠结肠病理组织评分比较，差异有统计学意义（t=12.469和12.581，均P=0.000）。TL具有减轻UC小鼠结肠局部病变损害的作用。见图2。

2.4　各组小鼠血清TNF-α浓度比较

空白对照组、生理盐水组、丙二醇组、地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 1、2、3组小鼠血清 TNF-α浓度分别为（173.332±18.288）、（388.302±30.202）、（341.322±31.202）、（195.620±18.208）、（231.408±22.608）、（338.36±18.931）、（243.526±23.462）和（197.066±20.108）pg/ml，经方差分析，差异有统计学意义（F=80.681，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，空白对照组与生理盐水组、丙二醇组小鼠血清TNF-α浓度比较，差异有统计学意义（t=17.221和13.138，均P=0.000），生理盐水组和丙二醇组小鼠血清TNF-α浓度较高；TL 2组与生理盐水组、丙二醇组小鼠血清TNF-α浓度比较，差异有统计学意义（t=10.707和7.086，均P=0.000），TL 2组小鼠血清TNF-α浓度较低；TL 3组与生理盐水组、丙二醇组小鼠血清TNF-α浓度比较，差异有统计学意义（t=14.908和10.992，均P=0.000），TL 3组小鼠血清TNF-α浓度较低；地塞米松组与生理盐水组、丙二醇组小鼠血清TNF-α浓度比较，差异有统计学意义（t=15.454和11.408，均P=0.000），地塞米松组小鼠血清TNF-α浓度较低；美沙拉嗪组与生理盐水组、丙二醇组小鼠血清TNF-α浓度比较，差异有统计学意义（t=11.763和8.068，均P=0.000），美沙拉嗪组小鼠血清TNF-α浓度较低。TL能降低UC小鼠血清TNF-α浓度。

2.5　各组小鼠TNF-α mRNA表达水平比较

空白对照组、生理盐水组、丙二醇组、地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 1、2、3组小鼠TNF-α mRNA相对表达量分别为（1.000±0.000）、（2.332±0.366）、（2.422±0.342）、（1.228±0.142）、（1.426±0.150）、（2.022±0.320）、（1.602±0.202）和（1.582±0.182），经方差分析，差异有统计学意义（F=19.500，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，空白对照组与生理盐水组、丙二醇组小鼠TNF-α mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（t=10.294和11.760，均P=0.000），空白对照组TNF-α mRNA微弱表达，生理盐水组和丙二醇组TNF-α mRNA表达上调；TL 2组与生理盐水组、丙二醇组小鼠TNF-α mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（t=4.939和5.839，均P=0.000），TL 2组较低；TL 3组与生理盐水组、丙二醇组小鼠TNF-α mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（t=5.190和6.133，均P=0.000），TL 3组较低。TL可抑制UC小鼠局部组织中TNF-α mRNA过表达。见图3。

图2　各组小鼠病理组织学图片（HE染色×200）

图3　各组小鼠TNF-α mRNA表达水平比较（n=10，±s）

2.6　各组小鼠TNF-α蛋白表达水平比较

空白对照组、生理盐水组、丙二醇组、地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 1、2、3组小鼠TNF-α蛋白相对表达量分别为（0.020±0.010）、（0.063±0.020）、（0.058±0.018）、（0.028±0.013）、（0.029±0.013）、（0.046±0.018）、（0.032±0.015） 和（0.030±0.014），经方差分析，差异有统计学意义（F=57.301，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，生理盐水组、丙二醇组与空白对照组小鼠TNF-α蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（t=5.439和5.220，均P=0.000），空白对照组小鼠TNF-α蛋白微弱表达，生理盐水组、丙二醇组TNF-α表达上调；地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 2、3组与生理盐水组小鼠TNF-α蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（t=4.150、4.032、3.507 和 3.823，P=0.004、0.002、0.001和0.001），地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 2、3组TNF-α蛋白表达水平较生理盐水组降低；地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 2、3组与丙二醇组小鼠TNF-α蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（t=3.822、3.694、3.139 和 3.473，P=0.002、0.002、0.007和0.004），地塞米松组、美沙拉嗪组，以及TL 2、3组TNF-α蛋白表达水平较丙二醇组降低。TL可抑制UC小鼠局部组织中TNF-α蛋白的合成。见图4。

图4　各组小鼠TNF-α蛋白的表达

3　讨论

TL具有广泛的免疫调节作用，但由于作用机制的广泛性及机体免疫系统的复杂性，其免疫调节机制并不十分清楚。就目前研究结果可知，其作用机制主要有抑制T细胞增殖或诱导T细胞凋亡、影响NF-κB活性、抑制肿瘤血管生成、抗氧化和抗脂质氧化等[8-17]。

张霞等[16]研究表明，TL可以抑制MOG35-55特异性T细胞增殖，抑制炎症细胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的表达，并增加IL-4、TGF-β的表达水平，同时抑制Nave T细胞向致病性Th1和Th17细胞的分化。兰雷等[17]研究表明，用TL对三硝基苯磺酸/乙醇性肠炎的大鼠模型进行处理，发现TL可减轻该模型的组织学损伤，下调促炎症细胞因子TNF-α、IL-1及黏附因子ICAM-1的表达水平；同时检测相应的NF-κB活性发现，治疗组较模型组明显受抑，提示TL能抑制NF-κB活化，从而使NF-κB调控的炎症介质产生减少，大鼠结肠组织损伤减轻。周鋆等[23]在复制UC大鼠模型的基础上，以雷公藤红素进行干预，发现高、低剂量雷公藤红素均能改善结肠组织大体和组织学评分，降低NF-κB、p65，以及TNF-α和TNF-αmRNA的表达，表明雷公藤红素对TNBS诱导的大鼠UC具有保护作用。TAO等[24]研究表明，TL可抑制结肠上皮下肌纤维母细胞内IL-8、MCP-1、MMP-3的表达而发挥抗炎效应，其作用机制主要是抑制IL-1β诱导的NF-κB激活。TAO等[25]另一项研究结果表明，TL可以减少TNBS诱导的UC模型小鼠结肠细胞外基质的沉积，以及减少胶原蛋白的产生，从而抑制结肠纤维化病变程度。YU等[26]研究显示，TL可明显改善实验小鼠结肠炎症状，作用机制可能是抑制TLRs/NF-κB信号通路，认为TL可作为Crohn's病的治疗方法之一，值得深入研究。LI等[27]研究表明，TL可以通过下调IL-6/STAT3/SOCS3信号通路抑制IL-17表达；组织学检查结果显示，C3H/HeJBir.IL-10缺失老鼠实验结肠炎症状明显改善。WEI等[28-29]研究表明，给予TL可以明显减轻IL-10缺失小鼠结肠炎的炎症程度和免疫功能紊乱，其机制可能是抑制IL-6/STAT3、TNF-α/TNFR2信号通路，认为TL可能适用于Crohn's病的维持治疗。本实验前期研究结果表明，分别通过TL、地塞米松治疗DSS诱导的UC小鼠，发现TL能减轻小鼠临床症状，并下调次级淋巴组织趋化因子的表达，提示TL可通过抑制SLC的过表达，而达到治疗UC的目的[30]。

本研究结果验证，TNF-α在UC的发生、发展中发挥重要作用，抑制其过表达对UC有治疗作用。同时发现TL 2、3组在给予TL治疗后，各组小鼠体重增加，一般情况好转，DAI评分、大体形态观察及评分、病理组织观察及评分均提示小鼠结肠炎症状缓解，结肠组织局部溃疡、糜烂好转，结果提示TL对UC有治疗作用，其疗效不低于有地塞米松、美沙拉嗪。同时发现给予TL治疗后，血清TNF-α浓度下降，局部结肠组织中TNF-α在mRNA和蛋白水平表达均下调，提示TL有抑制TNF-α过表达的作用。笔者认为TL具有抑抑制炎症的作用，对UC有治疗作用，可通过抑制TNF-α的过表达而发挥疗效，但其具体作用机制仍不明确。进一步明确TL在UC中的作用机制，将对UC的治疗，特别是对激素、美沙拉嗪类药物疗效欠佳的UC患者带来新希望。

综上所述，TL对UC有治疗作用，可能是通过抑制TNF-α的过表达而发挥作用，提示TL可能是一种有效的治疗UC的方法。