大型溞和金鱼藻对三种微藻增殖的影响

姜小玉，杨佩昀，王洁玉，赵闪闪，褚一凡，马剑敏

(河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007)

近30年来，我国富营养化湖泊快速发展[1]，藻类水华频繁发生。生态修复能够在较长时间尺度上使水华的爆发得到有效的控制[2]，其研究重点主要集中在经典生物操纵法[3]和水生植物的恢复与重建[4]。生物操纵即通过对湖泊中生物和环境的一系列调节，促进其中的一些相互作用，使浮游植物生物量下降，投加浮游动物是生物操纵理论的实施途径之一。浮游植物的生产力在水溞等枝角类浮游动物占优势的湖泊中明显较低[5-6]。因此，可以通过加入适量植食性枝角类浮游动物，使其达到并维持一定数量，抑制藻类的爆发式增殖，增加水体透明度[7]，减少富营养化现象的发生。现阶段，国内外利用浮游动物的滤食作用控制水体富营养化取得成功的例子不在少数。Pogozhev等[8]研究得出长刺溞(Daphnialongispina)能够有效减少铜绿微囊藻的生物量。张喜勤等[9]通过直接投放大型溞(D.magna)和方形网纹溞(Ceriodaphniaquadrangular)的方式治理长春南湖也获得初步成功。水生植物作为水生生态系统的初级生产者，既能够给浮游动物提供氧气和较好的栖息环境，影响浮游动物的种类组成，使浮游植物的爆发式增殖得到有效抑制[10]，又能够与浮游植物产生竞争抑制[11-12]，释放化感物质抑制藻类的生长[13-14]。生物操纵和水生植物的恢复与重建同时实施，能够有效抑制藻类增长。

本实验室前期研究发现，在藻-溞-草的微宇宙构建系统中，小球藻[15]、铜绿微囊藻[16]、小环藻[17]单独与大型溞、金鱼藻共培养，大型溞及金鱼藻的生物量均呈现上升趋势，且有效抑制了藻类的增殖。由于自然水体中，各门藻类混合生长，本研究模拟自然水生态条件，把不同微藻混合培养，研究大型溞和金鱼藻对其增殖的影响，便于找出藻类的竞争机理及水生动植物对浮游植物优势种形成的影响，进而更好地控制藻类水华的发生，为富营养化水体的治理提供更多的理论参考。

1　材料与方法

1.1　培养液的配制

按D-1培养液[18]和BG-11培养液[19]各自成分的50%等比例混合配置B+D培养液(经预实验筛选，适合所研究生物的生长)，调节pH值范围为(7.0～9.0)，所有培养液和器皿均需高压灭菌。

1.2　实验材料

小环藻(Cyclotellasp.，FACHB-1654)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa，FACHB-573，不产毒)、小球藻(Chlorellavugaris)：购自中科院水生生物研究所，保存在B+D培养液中，置于恒温培养箱(温度25 ℃，光照度2 600-3 000 lx，光暗比14 h∶10 h)。

大型溞(D.magna)：采自新乡市牧野湖，纯化培养后，单独培养驯化，培养条件同上，得到同一母体繁殖的、形态一致的幼龄大型溞用于实验。

金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)：采自新乡市牧野湖，用蒸馏水冲洗，去除表面泥沙和附着生物，培养于B+D培养液中，保证温度适宜、阳光充裕。实验时，选取生长较好、长势一致的金鱼藻顶枝，在蒸馏水中反复洗涤，用吸水纸吸干表面水分，称取0.1 g用于实验。

1.3　实验方法

1.3.1接种方法

在对数生长期，分别取出适量经扩大培养的三种藻液，离心(3 500 r/min，10 min)后，弃上清液，用无菌蒸馏水洗涤2次，将沉淀的三种微藻分别接种到无氮磷的B+D培养液中，饥饿处理7 d，去除藻细胞中蓄积的氮磷。然后按上述方法离心悬浮3次，弃上清液，按实验要求进行接种。均为无菌操作。

1.3.2小环藻、小球藻和铜绿微囊藻共培养

在250 mL的锥形瓶中加入200 mL B+D培养液，设三个平行，加入小环藻、小球藻和铜绿微囊藻各调节成1×105cells/mL的初始密度，置于恒温光照培养箱内(温度25 ℃，光照度2 600～3 000 lx，光暗比14 h∶10 h)，培养16 d，隔天加入适量培养液。每两天测定藻细胞密度。

1.3.3大型溞与三种藻共培养

在1 L的锥形瓶中加入800 mL B+D培养液，设三个平行，加入小环藻、小球藻和铜绿微囊藻各调节成1×105cells/mL的初始密度，然后放入5只大型溞，置于恒温光照培养箱内，培养16 d，隔天加入适量培养液。每两天测定藻细胞密度，最后测定大型溞的数目。

1.3.4金鱼藻与三种藻共培养

在1 L的锥形瓶中加入800 mL B+D培养液，设三个平行，加入小环藻、小球藻和铜绿微囊藻各调节成1×105cells/mL的初始密度，然后加入0.1 g金鱼藻顶枝，置于恒温光照培养箱内，培养16 d，隔天加入适量培养液。每两天测定藻细胞密度，最后测定金鱼藻的质量。

1.3.5大型溞和金鱼藻与三种藻共培养

在1 L的锥形瓶中加入800 mL B+D培养液，设三个平行，加入小环藻、小球藻和铜绿微囊藻各调节成1×105cells/mL的初始密度，然后加入5只大型溞和0.1 g金鱼藻顶枝，置于恒温光照培养箱内，培养16 d，隔天加入适量培养液。每两天测定藻细胞密度，最后测定大型溞的数目和金鱼藻的质量。

待闻知太子桥来历的游客走近细观，所见也不过是两块年代久远的长石板。其实看似简陋的石桥不平凡，石板两端的桥基是用干垒法构筑的石墩，精雕细凿的石栏虽已荡然无存，而桥面上碾出的两道石槽般深深的车辙却是历史的记忆。可想而知，这座小石桥千百年来碾过了多少木轱辘的牛车、马车、独轮车。如今看似沟渠的窄窄一条堰河，当年应该是山谷里汹涌的溪涧，两岸险峻的山道必是南来北往的商贩和方圆百十里村庄乡民上山下山必经之路。

1.4　测定指标

藻的细胞密度：每隔一天取10 mL样品，摇匀取出0.1 μL，通过显微镜用XB-K-25型细胞计数板计数，计算藻细胞密度。

大型溞数量：肉眼计数。

金鱼藻质量：用吸水纸吸干金鱼藻表面水分，用电子天平称重。

藻类增殖抑制率(I)=(1-D/D0)×100%

D和D0分别为处理组和对照组的藻细胞密度(×105cells/mL)，其中对照组是指三种藻共培养实验，处理组是指溞-藻，草-藻和溞-草-藻共培养实验。

1.5　数据处理

用Origin 8.5处理数据并制图，用SPSS 19.0对不同实验组的最大总藻细胞密度、同一实验组不同藻类的最大细胞密度、不同实验组同一藻类及同一实验组的不同藻类的增殖抑制率进行方差分析。P<0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1　三种藻共培养

在三种藻共培养的情况下，经过6 d，小环藻的细胞密度达到最大，为1.93×105cells/mL，之后逐步下降，于第16天完全死亡(图1-a)。小球藻的细胞密度于第12天达到最大，为5.34×106cells/mL，之后逐步下降(图1-b)。铜绿微囊藻在培养周期内持续增殖，到第16天最大细胞密度可达9.23×107cells/mL(图1-c)，极显著高于小环藻和小球藻的最大藻细胞密度，实验末期占总藻细胞密度的95.95%，最终成为优势种。三种藻共培养时，第16天最大总藻细胞密度可达9.62×107cells/mL(图1-d)。

图1　三种藻共培养时藻的细胞密度Fig.1　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algaea.小环藻；b.小球藻；c.铜绿微囊藻；d.总藻细胞密度

2.2　大型溞对三种藻增殖的影响

在大型溞和三种藻共培养的情况下，实验结束后，大型溞平均存活45只，增长了8倍，实验室已有研究发现，氮磷营养盐充裕的条件下，大型溞和铜绿微囊藻共培养，大概增长30倍[15]。此实验中大型溞没有大量增殖，说明藻类抑制了大型溞的增长。如图2，最大总藻细胞密度为6.5×106cells/mL，极显著低于三藻共培养实验，大型溞明显抑制了三种藻的增殖。小环藻、小球藻和铜绿微囊藻的细胞密度分别于第6天、第12天、第8天达到最大值而后逐步下降，此时，其藻类增殖抑制率分别为29.10%、-18.56%和99.82%(见表1)。这说明大型溞显著抑制了铜绿微囊藻的增殖(P<0.01)，削弱了铜绿微囊藻对其他两种微藻的抑制，由于小环藻增殖速率缓慢，最终小球藻成为优势种。

图2　大型溞与三种藻共培养时藻的细胞密度Fig.2　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algae with D.magna

2.3　金鱼藻对三种藻增殖的影响

图3　金鱼藻与三种藻共培养时藻的细胞密度Fig.3　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algae with C.demersum

2.4　大型溞和金鱼藻对三种藻增殖的影响

在大型溞、金鱼藻同时和三种藻共培养的情况下，大型溞平均存活283只，增长了55.6倍；金鱼藻的平均重量为0.142 g，增长了42%，长势良好。如图4，最大总藻细胞密度为5.8×106cells/mL，极显著低于三藻共培养实验(P<0.01)，说明浮游动物和沉水植物共同作用可以显著抑制藻类增殖。小环藻、小球藻和铜绿微囊藻的细胞密度分别于第4天、第10天和第8天达到最大值而后逐步下降，与2.1，2.2，2.3相比，提前进入衰减状态。此时，其藻类增殖抑制率分别为36.02%、-5.46%和99.91%(见表1)。这说明大型溞和金鱼藻联合作用极显著抑制了铜绿微囊藻的增殖(P<0.01)，削弱了铜绿微囊藻对其他微藻的竞争抑制，由于小环藻增殖速率缓慢，最终小球藻成为优势种。

图4　大型溞和金鱼藻与三种藻共培养时藻的细胞密度Fig.4　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algae with D.magna and C.demersum

2.5　不同实验组的增殖抑制率分析

如表1，单独使用大型溞或金鱼藻与三种藻共培养时，大型溞或金鱼藻对铜绿微囊藻的增殖抑制率没有显著差异，金鱼藻对小环藻和小球藻的增殖抑制率极显著低于大型溞，说明大型溞抑藻效果更好。大型溞和金鱼藻的联合作用比金鱼藻单独作用更能极显著抑制小环藻和小球藻的增殖，对铜绿微囊藻的抑制作用显著高于其他实验组，说明大型浮游动物和沉水植物的联合作用能够更好地抑制浮游藻类的增殖。在3组实验处理中，小球藻的增殖抑制率皆为负值，表明与三藻共培养实验相比，小球藻的最大细胞密度有所增加。因为无论加入大型溞，或金鱼藻，或两者同时加入，都会对铜绿微囊藻产生最大的抑制，削弱其对其他藻种的竞争抑制，改变三种藻之间的竞争态势，更有利于小球藻的增殖。

表1　不同实验组各微藻藻细胞密度最大时的增殖抑制率Tab.1　Growth inhibition rates of algae in the different experimental groups when the cell density was maximum (%)

注：平均值±标准误差；不同大写字母表示不同实验组差异极显著(P<0.01)

3　讨论

3.1　小环藻、小球藻和铜绿微囊藻之间的相互竞争

小球藻和铜绿微囊藻细胞较小，直径约为3～8 μm，增殖速率较快，而小环藻细胞相对较大，直径约为10～30 μm，增殖速率最慢。三种藻共培养实验中，藻类之间相互竞争，铜绿微囊藻增殖速率最快，占据绝对优势，因为蓝藻对营养[20]、光照[21]、空间、温度的适应性更强，其二氧化碳浓缩机制也可以极大地降低细胞光呼吸速率，减少不必要的生物能量消耗，迅速适应生存条件的改变。此外，蓝藻可通过合成与分解碳水化合物调控其在水中的浮力进而获得适宜生长条件[22]，为形成优势种提供便利。陈德辉等[23]通过微囊藻和栅藻竞争实验证明了蓝藻可以通过分泌有机化合物抑制其它藻的增殖。鉴于蓝藻本身的各种竞争优势，加之对其他藻种的增殖抑制，因此往往在藻种竞争中占据绝对优势地位，有关报道与此研究结果相似[24-25]。不同水华微藻之间的拮抗作用，可以稳定富营养化水体中的藻种数目，影响藻类比例，有效防御及治理藻类爆发性增殖。

3.2　大型溞对三种藻的抑藻效果

实验中的营养物质充足，生存条件适宜，但藻类生长不佳，大型溞明显抑制了藻类的增殖。实验结束时，总藻细胞密度6.5×106cells/mL，大型溞被抑制。研究发现[26]，当藻细胞密度较大时(超过4.11×106cells/mL)，大型溞的摄食速度、滤水速度和藻去除率都降低，大型溞对藻类的牧食速率小于藻类的增加速率，藻类快速繁殖，使培养液中原有的生态平衡被打破，导致大型溞的正常生长、发育、繁殖受到干扰，不利于大型溞的增殖。假设实验仍然进行，藻类可能爆发性增殖，从而进一步恶化水质。

因为不同藻种的毒性、适口性、营养含量有所差异，大型溞对不同藻类的滤食率也参差不齐[27]。三种藻分开培养时，藻细胞分布均匀，都能够被大型溞滤食。三种藻和大型溞共培养时，大型溞对铜绿微囊藻的抑制作用最为显著，对其增殖抑制率显著高于其他微藻，说明此时大型溞主要滤食铜绿微囊藻。铜绿微囊藻数量的急剧下降削弱了其对小环藻和小球藻的竞争抑制，由于小环藻生长速率缓慢，最终小球藻占优势。与三种藻共培养的实验相比，在与大型溞共培养实验中，铜绿微囊藻的细胞密度显著下降，优势种由铜绿微囊藻转换为小球藻，说明使用大型溞控制无毒的蓝藻水华是可行的[27]。

3.3　金鱼藻对三种藻的抑藻效果

苦草[28]、微齿眼子菜、穗状狐尾藻[29]等诸类水生植物都可以抑制藻类的增殖。矿质营养、光照强弱、水生植物分泌的活性物质及其根际微生物的作用是水生植物抑制藻类增殖的主要原因。本实验中，营养充裕，短时间内不干扰抑藻实验，光照能从各角度直接进入到锥形瓶上，避免遮光状况，所以可以排除营养和光照原因。故金鱼藻能显著抑制三种藻类的增殖可能是因为金鱼藻能分泌抑藻物质，与Scheffer等[13]结果一致。

由于铜绿微囊藻被显著抑制，小环藻生长速率缓慢，小球藻迅速增殖，最终发展成为优势种，而三种藻共培养实验中铜绿微囊藻占优势，金鱼藻对混合藻类的抑制作用可以导致优势种的转变，因为化感作用具有一定的选择性，对不同藻类的抑制机理也不完全相同[30]。实验结束后，金鱼藻叶子只剩一半，不及初始质量，说明藻类的增殖可以在一定程度抑制金鱼藻的生长，如果藻类继续无节制地增殖，会使金鱼藻全部死亡，进一步恶化水质。

3.4　大型溞和金鱼藻对三种藻的抑藻效果

通过向培养液中单独投加大型溞、金鱼藻或二者同时加入，都可以对铜绿微囊藻产生最大的抑制，削弱其对小环藻和小球藻的竞争抑制，小球藻比三藻共培养实验长得更好。因为三藻共培养时，小环藻增殖最慢，不管是否投加大型溞或金鱼藻，实验末期小环藻细胞密度都是最低的，单独加入大型溞或同时加入大型溞和金鱼藻，会进一步降低小环藻的细胞密度，但是影响不大。大型溞和金鱼藻同时加入藻类培养液，在共培养实验中抑藻效果最好。大型溞和金鱼藻长势良好，三种藻均得到了有效抑制。把大型溞等大型枝角类浮游动物投入富营养化水体中，主要是借助大型溞有效滤食浮游藻类和微小的有机颗粒物，另辅以水生植被的恢复与重建，为净化水质营造良好的水生态基础[31]。水生植物能够与浮游藻类竞争各种生长资源，分泌化学活性物质抑制藻类增殖，还能为浮游动物输送氧气，提供栖息地等，间接对藻类增殖起到控制作用。所以，生物操纵和水生植物的恢复与重建相辅相成，可长期稳定改善水质。Blindow等[32]也提出，应在生物操纵之后实施水生植被的恢复与重建，这样才能保证湖泊生态系统的正常功能。

生物操纵和水生植被的恢复与重建相结合，可以控制藻类爆发性增殖，减少水华发生的概率，净化水质，更有利于生态修复技术控藻的有效性与长期性。但是实验室模拟自然水生态条件下所得结果仅为理论参考，若投入正式实践还需结合野外水体做进一步研究。

4　结论

用B+D培养液，在温度25 ℃、光照度2 600～3 000 lx、光暗比14 h∶10 h的条件下，当小环藻、小球藻和铜绿微囊藻共培养时，铜绿微囊藻在竞争中占绝对优势，成为优势种；当大型溞或金鱼藻其一与三种藻共培养时，均对三种藻(尤其对铜绿微囊藻)的增殖有明显的抑制作用，最终小球藻占优势，大型溞的抑制效果好于金鱼藻；当大型溞和金鱼藻与三种藻共培养时，对三种藻的抑制效果达到最大。