金露梅与珠芽蓼草粉对模拟瘤胃体外发酵的影响

薛世魁 金珍 王雪郦

摘要：以6头体重35 kg左右、安装永久性瘤胃瘘管的健康羯羊为瘤胃液供体动物，用持续人工瘤胃装置（RUSITEC），基础日粮混合料为底物进行体外发酵试验，研究添加富含植物次生代谢物的金露梅与珠芽蓼草粉对瘤胃发酵的影响，以筛选天然饲料添加剂。结果表明，基础日粮中添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉与普通基础日粮之间，发酵液pH、甲烷、挥发性脂肪酸的产生量及干物质消失率差异均不显著（P > 0.05），但有降低甲烷产量、提高干物质消化率的趋势。因此，在本试验条件下，添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉对瘤胃发酵的作用不显著，不适合做饲料添加剂。

关键词：植物次生代谢物；体外模拟瘤胃发酵；金露梅；珠芽蓼；草粉

中图分类号：S816.7 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）02-0063-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.02.017

Effects of Grass Powder of Potentilla fruticosa L. and Polygonum viviparum L. on Simulated Rumen Fermentation in Vitro

XUE Shikui 1， JIN Zhen 2， WANG Xueli 1

（1. Animal Health Supervision Institute， Chengguan District， Lanzhou Gansu 730000， China； 2. Animal Disease Prevention and Control Center， Chengguan District， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract：The 6 healthy wether， weight about 35 kg， was fitted with permanent rumen fistula as rumen fluid donor， with continuous artificial rumen device （RUSITEC）. Basic diet mixture as a substrate in vitro fermentation experiment， the study was done to add grass powder of Potentilla fruticosa L. and Polygonum viviparum L. rich in plant secondary metabolites on rumen fermentation in RUSITEC， with screening of natural feed additives. The results show that the yield and dry matter disappearance rate of fermentation liquid pH，methane and volatile fatty acid had no significant difference （P > 0.05） between basic diets supplemented with grass powder of 10% Potentilla fruticosa L. and 10% Polygonum viviparum L. and ordinary diet， but there is a trend to increase the dry matter degradation and decrease the methane production. Therefore， under the conditions of this experiment， the effect of adding grass powder of grass powder of 10% Potentilla fruticosa L. and 10% Polygonum viviparum L. on rumen fermentation was not significant， it is not suitable to choose as a feed additive.

Key words：Plant secondary metabolites；Simulated rumen fermentation in vitro；Potentilla fruticosa L.；Polygonum viviparum L.；Grass powder

提高飼料转化率，一直是动物营养学家关注的最重要问题之一。在反刍动物瘤胃厌氧发酵过程中，甲烷的产生意味着饲料能量损失和对环境产生温室效应。因此，在反刍动物生产中，如何减少瘤胃甲烷排放，提高瘤胃发酵效率，不仅关系到饲料利用效率，而且也与维护大气环境有关，这已是反刍动物营养研究的一个重要方向[1 ]。然而，至今人们找到唯一有效降低瘤胃甲烷的化学抑制剂是离子载体，它可抑制供给甲烷形成所需的氢气[2 ]，减少甲烷排放量高达25%[3 ]。但自2006年欧盟各国限制应用抗生素类添加剂以来，绿色饲料添加剂越来越受到广泛的关注。研究发现，具有特殊生物活性的植物次生代谢物，动物所采食虽然富含这些化合物的饲草料不一定能提供营养，但会影响动物的消化、代谢过程[4 ]，调控瘤胃发酵模式，提高氮存留，减少甲烷排放[5 ]；一些酚类化合物、精油和丝兰皂甙具有抗菌活性，还可替代抗生素作饲料添加剂[6 ]，所以，在生产实践中若能科学合理地利用植物次生代谢物，将提高饲料利用率，改变瘤胃发酵模式和产物，最终提高宿主动物生产性能[7 ]。含有高浓度次生代谢化合物的植物也许将是最有潜力的候选添加 剂[3 ]，在瘤胃调控中将有更广的研究与应用前 景[7 ]。

目前，有人已对一些植物进行了测试，研究了植物性添加剂对瘤胃发酵调控和降低甲烷产量的可能性[8 ]。然而，此类天然绿色添加剂的研发，需要继续进行大量体外筛选工作[6， 9 ]。基于植物次生代谢物的特殊生物活性，富含这些化合物的植物将被选做候选添加剂[8 ]。在我国青藏高原地区，由于其特殊的地理环境，牧草含有较多植物次生代谢物[10 ]。其中金露梅与珠芽蓼是该区两种常见植物，也是藏药原料成分，生物碱类、黄酮类、皂苷类、甾醇类、植物精油、单宁等含量较高[11 - 12 ]。我们利用持续人工瘤胃装置，研究添加金露梅与珠芽蓼两种草粉对瘤胃发酵和甲烷产量的影响，以探讨其是否适于选做天然绿色添加剂。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用日粮各种原料由甘肃农业大学动物科学技术学院科研训练基地提供。金露梅与珠芽蓼于其生长季的7月底采自甘肃省天祝县海拔 3 450～3 500 m的金强河高山草地。采样时随机剖出10个1 m×1 m的样方框，采集开花期金露梅嫩枝叶和开花前期珠芽蓼地上部，采后称鲜重，置于105 ℃烘箱中烘5 min迅速杀青，之后在70 ℃烘干至恒重后经粉碎过1 mm筛备用。所用体外模拟发酵装置为2010年日本生产的持续动态人工瘤胃装置RUSITECH（R-S，Shina-gawa）。

1.2 试验方法

采用完全随机试验设计，将金露梅和珠芽蓼草粉以配合饲料中添加剂最高比例10%的标准添加。分3组，分别为对照组（CK）（基础日粮）、处理1（金露梅替换10%的基础日粮）、处理2（珠芽蓼替换10%基础日粮）。基础日粮参照《中国美利奴育成公羊饲养标准》，以绵羊日增重为50 g对能量和蛋白质需要量配制试验日粮配方（表1）。精料由玉米和豆粕组成，粗料为苜蓿干草和小麦秸秆，精粗质量比为40∶60。人工瘤胃试验营养水平（风干基础）为：干物质901.4 g/kg、粗蛋白93.2 g/kg、消化能8.48 MJ/kg、钙4.0 g/kg、磷1.8 g/kg。

1.3 人工瘤胃

1.3.1 缓冲溶液配制 人工瘤胃缓冲溶液按McDougall配方配制：NaHCO3 9.8 g/L、Na2HPO4·12H2O 9.3 g/L、NaCl 0.47 g/L、KCl 0.57 g/L、MgSO4·7H2O 0.12 g/L、CaCl2·2H2O 0.045 g/L，蒸馏水1 000 mL。配制时除CaCl2·2H2O以外的试剂用1 000 mL蒸馏水充分溶解后再加入CaCl2·2H2O，然后持续通入CO2，使溶液pH为6.9±0.1[13 ]。

1.3.2 人工瘤胃液准备 瘤胃液采自6头体重35 kg左右、安装永久性瘤胃瘘管的健康羯绵羊作为培养液的供体羊，饲喂基础日粮。每天饲喂2次（08：00、20：00时），自由饮水。晨饲前分别从6头供体羊瘤胃中采集瘤胃液约3 500 mL，混合后用保温瓶迅速带回实验室，用四层纱布过滤，整个操作于39 ℃水浴中进行。过滤后取3 200 mL瘤胃液摇匀分成8份，加入已分别装有400 mL缓冲液的8个发酵罐内，持续通入CO2气体2～3 min保持发酵罐内部厌氧环境。

1.3.3 人工瘤胃工作条件参数 人工瘤胃的工作条件为稀释率0.7 /d，缓冲液流量0.39 mL/min，流出液口筛网孔径为1.2 mm，补料量为20 g/d，发酵罐内温度为39 ℃，充CO2至厌氧环境，缓冲液与瘤胃液按体积比1∶1比例添加。

1.3.4 人工瘤胃操作与样品采集 将供试原料风干，粉碎，按试验设计准确称取后混合均匀，配制试验全期的总用量。称取10 g分装于孔径为50 μm、尺寸为7 cm×13 cm的尼龙袋中备用。每天分别于08：30时和20：30时进行補料。首先向每个发酵罐加入预先准备好的混合日粮10 g，补料完毕充CO2气体2～3 min，以维持发酵罐内厌氧环境。

1.3.5 发酵试验 连续进行两期发酵试验。每期试验包括7 d预试期和2 d正试期。于正试期第1天用集气袋收集24 h的产气并记录产气量，将部分气体转移到采气袋，以备测定甲烷产量。第2天，投料后3、6、9、24 h经取样口采集发酵液，加1滴饱和HgCl溶液后立即测定pH，然后于-20 ℃冷冻保存，以备其他发酵产物的测定。收集发酵罐内尼龙袋食糜，于65 ℃烘箱烘干，粉碎，待测干物质降解率。

1.4 测定指标及样品分析方法

1.4.1 发酵24 h总产气量 用集气袋收集，然后用气量计测定总量。

1.4.2 不同时间点发酵液pH 用pH计（pHS-3C，上海雷磁仪器厂）测定。

1.4.3 甲烷 用气相色谱仪（BeifenHP-3420A型）测定。测定条件为柱温80 ℃，气化室温度100 ℃，检测室温度120 ℃；载气使用高纯氮气，总压力130 kPa，总流量30.2 mL/min，柱流量1.7 mL/min，线速度39.8 cm/s，分流比15，吹扫流量3 mL/min，循环流量8 mL/min，H2流量40 mL/min，空气流量400 mL/min[14 ]。

1.4.4 挥发性脂肪酸（VFA） 用气相色谱仪（Beifen HP-3420A型）测定。样品预处理：解冻-20 ℃保存的发酵液样品，10 000 g离心10 min，取上清 液1 mL加25%偏磷酸0.1 mL，静置30 min，在 10 000 g下离心10 min，保留上清液待测。色谱条件为色谱柱2 m×3 mm内装5%聚二乙二醇丁二酸酯（DEGS）+1%磷酸的不锈钢柱。仪器条件为柱温以2 ℃/min由110 ℃升至120 ℃，进样器、检测器温度200 ℃；载气N2流速20 mL/min、氢气流速30 mL/min、空气流速300 mL/min[15 ]。

1.5 数据处理与统计分析

基础数据用Excel整理后，用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析处理，显著性水平为0.05。差异显著性用Duncan氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 金露梅和珠芽蓼草粉对干物质消失率、 总产气量与甲烷产量的影响

从表2可以看出，与对照相比，添加10%金露梅和10%珠芽蓼的处理，干物质消失率较高，而总产气量和甲烷产量与均较对照有所下降，但差异都不显著（P > 0.05）。

2.2 金露梅和珠芽蓼草粉对瘤胃液pH的影响

从表3可以看出，添加10%的金露梅和10%珠芽蓼时，人工瘤胃发酵罐内不同时间瘤胃液pH变化范围在6.83～6.97，没有产生显著影响（P >0.05）。发酵24 h后，各处理的pH均低于投料后3 h的测定值（P > 0.05）。

2.3 金露梅和珠芽蓼草粉对瘤胃液挥发性脂肪酸浓度的影响

从表4可以看出，基础日粮中添加10%金露梅和10%珠芽蓼的处理，发酵产生的丙酸和丁酸浓度均高于对照，而乙酸、戊酸浓度低于对照，差异均不显著（P > 0.05）。各处理乙酸/丙酸和（乙酸+正丁酸）/丙酸比值差异不显著，添加10%金露梅和10%珠芽蓼的处理均低于对照。各处理的总挥发性脂肪酸含量差异不显著（P > 0.05），但添加10%金露梅和10%珠芽蓼处理的测定结果略高于对照。

3 小结与讨论

研究结果表明，基础日粮中添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉与普通基础日粮之间发酵液pH、甲烷、挥发性脂肪酸的产生量及干物质消失率差异均不显著（P > 0.05），但有降低甲烷产量，提高干物质消化率的趋势。体外发酵液pH为6.83～6.94，高于王永梅等（6.04～5.90）和陆燕等人的试验结果（6.61～6.76）[16 - 17 ]，总体高于不用瘤胃模拟装置的体外发酵试验结果（6.50～6.40）[18 ]，原因可能与本试验过程中，人工瘤胃装置通过蠕动泵持续不断的泵入人工唾液，发酵产物不断溢出模拟瘤胃有关。pH变化范围处于瘤胃液正常范围（pH为6.4～7.4）内，适合瘤胃内微生物的生存条件，不会影响瘤胃的发酵功能[19 ]。

许多体外试验发现，植物次生代谢物对动物瘤胃发酵的影响效果不同，有时甚至得出自相矛盾的结果，是因为植物次生代谢物的添加剂量、化学组成、纯度、日粮类型、瘤胃微生物的适应性， 以及植物次生代谢物存在形式、体外发酵装置都会影响瘤胃发酵[6 ]。有文献报道，与本试验同年采集时间接近的8月1号所采金露梅与珠芽蓼中缩合单宁含量分别为4.51%和2.76%，其纯化缩合单宁在体外产气法试验中，对总产气量和甲烷产量的抑制作用较明显[20 ]。而在本试验，处理组较对照的产气量和甲烷产量仅有降低的趋势，也许是10%添加量中的单宁不足以产生显著的影响，再者，日粮类型与缩合单宁纯度都可能是影响瘤胃发酵的因素。有研究表明，饲料消化率与体外培养时的产气量具有高度相关性，产气量越高，饲料在瘤胃内的降解率越高[21 ]。但本试验处理组干物质降解率变化趋势与产气量和甲烷产量相反，也许是由于开花期金露梅与开花前期的珠芽蓼本身消化率较高，故处理组的干物质降解率较对照高。虽然金露梅与珠芽蓼含有较多植物次生代谢物，但10%添加量中的单宁不足以影响微生物对纤维的消化，最终表现是干物质降解率和总产气量，以及甲烷产量差异均不显著[6 ]。

瘤胃中的饲料被降解，产生挥发性脂肪酸（VFA）的同时产生大量甲烷（CH4）。挥发性脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，其含量和组成，是反映瘤胃微生物发酵活动的重要指标。本试验三组处理的总挥发性脂肪酸测定结果与王银山等人的报道一致[22 ]。在瘤胃发酵中，生成乙酸和丁酸的过程产生氢，甲烷可消除发酵中过多的氢，是氢的“平衡器”，因此氢是限制甲烷产生的第一要素。当乙酸和丁酸比例较高时，产生较多的氢，甲烷生成量增加；而当丙酸比例增高时，相应甲烷产量降低。所以添加金露梅和珠芽蓼后，乙酸、丁酸浓度，乙酸/丙酸及甲烷产量均有低于对照组的趋势，符合瘤胃发酵一般规律。曾有研究报道，瘤胃发酵产生的甲烷量，对植物次生代谢物，有剂量依赖性[23 ]。本试验添加金露梅和珠芽蓼降低甲烷产量的效果不显著，可能与添加量有关。

戊酸与含4个或5个碳原子的支链脂肪酸2-甲基丁酸、异丁酸和异戊酸，合称为异位酸[24 ]。它们是促进瘤胃纤维分解菌生长的主要营养物质，对瘤胃内纤维的降解有重要影响，可提高瘤胃对植物细胞壁的消化能力，促进纤维的消化[25 ]。从本试验数据可知，与对照相比，添加两种草粉的处理组戊酸和异丁酸比例有所下降，而干物质降解率有较高的趋势，推测可能是戊酸和异丁酸被纤维分解菌利用，促进了分解菌繁殖，利于干物质降解率；两种草粉可能对瘤胃微生物区系有影响，进而对瘤胃发酵粗纖维饲料有改善。而处理组比对照异戊酸测定值较高（P > 0.05），可能是由于异戊酸与饲料纤维降解作用无关[26 ]。

在本试验条件下，添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉，对瘤胃发酵的作用效果不显著；也许与两种植物的添加量，或者日粮类型有关，导致结果不显著。据此认为，选择10%金露梅和10%珠芽蓼草粉作添加剂不可行。

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（本文责编：陈 伟）